【摘 要】
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禽流感的流行给世界带来了巨大损失,不仅仅表现在养殖业,人类的健康和生命也同时受到了威胁,H4N6作为低致病性的禽流感往往受到忽视,但是鉴于诸多的低致病性禽流感也可以引起流感病毒的大流行,而且往往其带来的灾难令人震惊的缘故,人类应该越来越重视低致病性禽流感的研究,并对其机理、致病性、生物学特性进行深入的研究,以便为以后的分子生物学的研究提供资料。 流感病毒的拯救（the rescue of
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禽流感的流行给世界带来了巨大损失,不仅仅表现在养殖业,人类的健康和生命也同时受到了威胁,H4N6作为低致病性的禽流感往往受到忽视,但是鉴于诸多的低致病性禽流感也可以引起流感病毒的大流行,而且往往其带来的灾难令人震惊的缘故,人类应该越来越重视低致病性禽流感的研究,并对其机理、致病性、生物学特性进行深入的研究,以便为以后的分子生物学的研究提供资料。 流感病毒的拯救（the rescue of virus）是一种反向遗传操作技术（Reverse Genetics）,也有人翻译成为“反向遗传学”或“反义遗传学”,即病毒的全长感染性cDNA克隆技术。通过构建RNA病毒的感染性分子克隆,在病毒cDNA分子水平上对其进行体外人工操作,可以进行基因点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等方法对其进行改造,并且在培养的细胞或易感宿主中重新拯救（rescue）出活病毒或类似病毒的物质,是一种人为构建有感染性RNA的技术,同时也是目前反向遗传操作技术应用于病毒研究的热点。而8质粒系统的构建成功,标志又一大突破性的进展,本实验根据该原则,对重组H4N6亚型的禽流感进行拯救。 一H4N6八质粒拯救系统的构建 本实验应用了已构建好的phw2008双向转录/表达载体,其上含有人RNA聚合酶Ⅰ启动子（PIh）、鼠RNA聚合酶Ⅰ终止子（tl）,polⅡ启动子和终止子,可以完成转录和表达蛋白的同时进行。将H4N6的HA和NA基因克隆到phw2008载体上,并且与phw2008-PA、phw2008-PB2、phw2008-PB1、phw2008-NP、phw2008-NS、phw2008-M共同组成了8质粒拯救系统。 二、重组H4N6亚型流感病毒的拯救 构建了phw2008-EGFP载体,并且将phw2008-EGFP重组体在细胞中进行转染,验证了双向转录/表达载体phw2008的转染效率及荧光表达,为了下一步的病毒拯救做了铺垫。将以上8质粒共转染293T与MDCK细胞,同时应用细胞中本身具有的聚合酶Ⅰ和Ⅱ,启动双向转录/表达载体上的启动子,同时转录出vRNA和mRNA,最终完成病毒粒子的包装。 三、拯救病毒的鉴定及其生物学特性分析 通过应用RT-PCR、血凝实验、电泳条带图、电镜下观察等方法验证了实验的正确性,并且对其生物学特性进行了分析,为流感病毒变异机理的研究奠定了坚实的基础,同时提供了强有利的借鉴依据.
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