动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是40岁以上男性和绝经期后女性常见的血管病变,是心脑血管疾病的主要病理学基础。深入研究AS的发病机制及调控机制,为治疗AS寻找新的靶点及治疗方法,已成为当前研究的重要目标之一。在AS的发病过程中,多种细胞和因子参与了其形成,包括内皮细胞、平滑肌细胞、白细胞等。目前至少有3种关于动脉粥样硬化发病机制的学说,即脂质浸润学说、内皮损伤反应学说、血管平滑肌细胞增殖迁移学说。目前比较公认的是内皮损伤反应学说。内皮损伤反应学说认为,动脉粥样斑块的形成是动脉对内皮损伤的反应,AS病变始于内皮细胞损伤。引起内皮损伤的主要原因有高血压、剪切应力,oxLDL和胆固醇增高等,其中oxLDL是主要的损伤因素。内皮损伤可破坏内膜的渗透屏障作用和内皮表面抗血栓形成的特性、增加血管活性因子、脂解酶和生长因子释放等。因此,保护血管内皮将会在源头上抑制AS的发生发展。凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin like low-density lipoprotein receptor-1, LOX-1)是不同于其他清道夫受体的、大量存在于血管内皮细胞、平滑肌细胞及肺等组织中的oxLDL特异性受体。研究表明,oxLDL可与其受体LOX-1结合,促使LOX-1表达上调。现认为,LOX-1表达和活化在AS的全过程(从内皮活化和凋亡至斑块破裂)都存在,LOX-1上调是AS等血管性疾病的启动因素[7-8]。因此,抑制LOX-1的上调,可从源头上阻止oxLDL对血管内皮的损伤,消除损坏血管功能的触发因素,从而保护血管功能,对防止AS的发生具有重要的意义。但LOX-1的调控机制目前仍不明确。microRNA是一类长度为18-25bp、内源性、非编码单链小分子RNA,其序列在物种间高度保守。参与了包括生物体发育、细胞分化增殖、组织器官形成在内的多种生理和病理过程。研究表明,人类基因中有近三分之一的基因受microRNA的调控。因此,microRNA很可能参与了LOX-1表达的调控。另一方面,同其他基因的表达相似,microRNA的编码基因同样需经细胞核内转录、及修饰最后形成有功能的成熟microRNA。然而,目前对于nicroRNA转录调控的研究还较少。研究证明,microRNA与转录因子的关系十分密切。超过一半的microRNA通过调控转录因子的表达水平来实现在细胞分化、增殖、信号转导的调控功能。而在pri-microRNA的转录阶段也受到转录因子的调控,转录因子通过结合在microRNA的转录起始区域,调节pri-microRNA的转录,来达到对microRNA表达调控。MicroRNA与特定的转录因子之间组成了错综复杂的调控网络。由于在内皮细胞中,oxLDL可通过LOX-1及下游信号途径,引起转录因子NF-κB的活化。因此,NF-κB是否也参与了调控LOX-1的microRNA的生成,从而形成一个信号调控反馈环路,迄今未见有论文发表。因此我们大胆设想,在oxLDL损伤的内皮细胞中,microRNAs参与了oxLDL引起的LOX-1表达上调,并通过LOX-1/p38MAPK/NF-KB信号通路影响转录因子NF-κB的表达,进而影响内皮细胞的功能。另一方面,NF-κB又会反馈性作用于microRNA的生成,并形成是信号调控环路,在AS这一病理过程中中发挥重要的作用。为证明此假说,本项目拟在细胞水平通过基因转染和基因干扰等技术证实microRNA与LOX-1的关系,明确microRNA参与了oxLDL导致的内皮细胞功能及结构损伤,揭示microRNA/LOX-1/ROS/p38MAPK/NF-KB/microRNA调控环路的存在,研究将揭示microRNA与AS发生发展的关系及其信号转导途径,无疑具有理论意义和应用价值。课题的实施可望为AS的防治提供一种新思路和药物作用新靶点。第一部分靶向作用于LOX-1的microRNA的筛选目的：筛选出靶向作用于LOX-1的microRNA。方法：以microrna.org、targetscan、pictar网站预测靶向作用于LOX-13’-UTR区的microRNA,选出可同时被两种及以上软件预测的microRNA;以150μg/ml的oxLDL处理内皮细胞24小时,实时定量PCR法测定oxLDL损伤的人脐静脉内皮细胞中,预测microRNA的表达变化；构建融合有LOX-13’-UTR区的双荧光报告基因载体,以双荧光报告基因检测试剂盒检测所选microRNA对双荧光报告基因表达的影响；并用实时定量PCR法测定正常内皮细胞中let-7家族表达谱；以let-7a、let-7b、let-7c mimics转染HUVEC,观察其对内皮细胞内源性LOX-1mRNA和蛋白表达的影响。结果：生物信息学法预测表明多个microRNA均可与LOX-13’-UTR结合,其中miR-590、miR-18b、miR-21、let-7家族可同时被两个以上软件同时预测到。以50、100、150、200μg/ml的oxLDL处理HUVEC24小时后,细胞活力分别降为原来的98.3%、73.1%、55.1%和44.3%。而150μg/ml oxLDL处理24小时后,内皮细胞中miR-590、miR-18b、let-7家族均呈现不同程度的下调,其中下调程度最大的为miR-590和let-7b,分别下降为正常对照组的24.4%和12.1%。双荧光报告基因结果表明,miR-590不能直接抑制报告基因的表达,但是let-7家族的let-7a、let-7b、let-7c、let-7g和miR-98,可明显抑制双荧光报告基因的表达。在正常培养的HUVEC中,let-7a、let-7b、let-7c的表达丰度明显高于其他成员。以75nM的let-7a、let-7b、let-7c mimics转染HUVEC后,细胞中LOX-1mRNA和蛋白的水平均明显降低。结论：1、1et-7a、let-7b、let-7c、let-7g、miR-98为靶向作用于LOX-1的microRNA;2、在HUVEC细胞中,let-7a、let-7b、let-7c的表达高于其他家族成员；3、let-7a、let-7b、let-7c可下调HUVEC内源性的LOX-1表达第二部分let-7c/LOX-1/NF-κB信号调控环路研究目的：研究let-7与NF-κB的相互调控作用,并验证let-7c/LOX-1/NF-KB反馈调控环路的存在。方法：采用瞬时转染法使HUVEC内let-7a、let-7b、let-7c过表达Western-blot测定let-7a、let-7b、let-7c过表达后p38MAPK、p-p38MAPK、NF-κB p65(胞核及胞浆)蛋白表达。采用siLOX-1、NF-κB抑制剂PDTC、p38MAPK抑制剂SB203580处理]HUVEC后,实时定量PCR法测定let-7a、let-7b、let-7c的改变。构建不同长度(-1.5kb,-2.0kb,-2.0kb-mut)的野生型和突变型miR-99a/let-7c启动子报告基因载体,将其分别与NF-κB p65口／或p50亚基共转染HUVEC,双荧光报告基因检测试剂盒检测报告基因荧光表达变化。采用凝胶迁移实验(EMSA)对NF-κB与miR-99a/let-7c启动子DNA的结合进行验证。以NF-κB p65和／或p50亚基转染HUVEC,实时定量PCR检测NF-κB过表达后,细胞内miR-99a和let-7c前体及成熟体表达的变化。结果：let-7a、let-7b、let-7c过表达后p-p38MAPK/p38MAPK分别降低为阴性对照组的0.65倍、0.58倍和0.62倍；细胞核内NF-κB (p65)占总NF-κB (p65)比例由阴性对照组的48.5%分别降低为34.8%、32.5%、20.9%；siLOX-1转染HUVEC后,实时定量PCR未能检测到LOX-1mRNA表达,而LOX-1蛋白表达明显降低。siLOX-1、PDTC. SB203580处理HUVEC24小时后,let-7a、let-7b、 let-7c表达明显降低,其中PDTC可使let-7a、Iet-7b、let-7c均降低为阴性对照组的1%以下。双荧光报告基因结果表明,NF-κBp65和p50均能不同程度的促进-2.0kb的报告基因的表达,而对-1643至-1652位突变的-2.0kb启动子报告基因、-1.5kb启动子报告基因作用则明显减弱。EMSA实验表明NF-κB可特异性的与miR-99a/let-7c启动子的-1643至-1652位点结合。NF-κBp65和p50过表达对HUVEC内源性的pre-miR-99a、pre-let-7c、miR-99a、let-7c具有上调的作用。结论：NF-κB可与miR-99a/let-7c启动子-1643～-1652位结合,直接调控let-7c的表达；let-7c/LOX-1/NF-KB之间存在负反馈调控环路第三部分let-7a、let-7b、let-7c对oxLDL所致人血管内皮损伤的抑制作用及其机制研究目的：研究let-7a、let-7b、let-7c对oxLDL所致的内皮细胞损伤的抑制作用及机制。方法：以实时定量PCR法检测oxLDL不同浓度和不同时间处理HUVEC后,let-7a、let-7b、let-7c表达变化；利用let-7a、let-7b、let-7c mimics转染HUVEC,使其过表达；MTS法测定let-7a、let-7b、let-7c过表达对细胞活力的影响；细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)和一氧化氮(NO)含量采用试剂盒测定；细胞凋亡采用Hoechst33342和流式细胞术测定；细胞内活性氧含量采用DCFH-DA法测定；LOX-1和内皮型一氧化氮合酶(eNOS) mRNA采用实时定量PCR法测定；LOX-1、p38MAPK、NF-κB蛋白表达及核易位采用Western-blot法测定。结果：以不同浓度oxLDL处理内皮细胞24小时,或以150μg/ml的oxLDL处理细胞不同时间,可以使let-7a、let-7b、let-7c表达呈剂量或浓度依赖性的下降；oxLDL(150μg/ml)处理24小时后,细胞活力显著下降、LDH释放明显增加、NO释放明显减少；而let-7a、let-7b、let-7c过表达可不同程度的抑制oxLDL所致的上述作用。内皮细胞单独转染let-7a、let-7b、let-7c后,内皮细胞中NO水平明显上升。Hoechst染色和流式细胞术结果表明,oxLDL(150μg/ml)处理24小时后,内皮细胞凋亡率明显增加；而let-7a、let-7b、let-7c过表达可不同程度的抑制oxLDL所致的凋亡率升高。DCFH-DA染色、Western-blot和实时定量PCR结果表明,let-7a、let-7b、let-7c过表达可明显抑制oxLDL所致的ROS生成增加、p38MAPK磷酸化、PKB去磷酸化、NF-κB核易位、LOX-1表达上调和eNOS表达下调。结论：1)在oxLDL损伤的内皮细胞中,let-7a、let-7b、let-7c的表达被抑制,并呈时间和浓度依赖性；2)let-7a、let-7b、let-7c过表达可以对抗oxLDL所致的内皮细胞凋亡和分泌功能改变；3)let-7a、let-7b、let-7c保护内皮的作用与LOX-1/ROS/p38MAPK/NF-κB通路及LOX-1/ROS/PKB/eNOS通路有关。