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目的:建立直接测定肝豆状核变性(Hepatolenticular degeneration,HLD;Wilson’s disease,WD)基因(ATP7B)全部外显子序列的方法;测定湖南地区WD患者ATP7B基因外显子、外显子/内含子交界区序列,了解湖南地区WD基因突变类型,掌握湖南地区WD基因突变的规律和突变热点;建立多重PCR反向杂交技术检测WD基因突变的方法,初步探讨多重PCR反向杂交技术检测WD基因突变热点的可行性、敏感性和特异性。方法:1.ATP7B基因外显子突变热点的检测与分析:抽取32例WD患者外周血,酚氯仿法提取DNA,针对ATP7B基因21个外显子设计引物,PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下割取目的条带,纯化回收PCR产物,对PCR产物测序,进行BLAST分析,得到ATP7B基因突变位点。2.多重PCR反向杂交技术快速检测ATP7B基因突变:针对ATP7B基因第8及12外显子R778L、A952K突变热点设计两组共四条检测探针G2333(R778)、G2855(A952)、T2333(L778)、A2855(K952),并将探针固定于尼龙膜。设计突变热点所在的第8及12外显子引物并以生物素标记,多重PCR扩增后,将扩增产物与固定于尼龙膜的探针杂交。用链亲合素-碱性磷酸酶结合蛋白与生物素结合,经过染色观察结果。研究多重PCR反向杂交技术检测ATP7B基因突变可行性。3.将多重PCR反向杂交技术检测的结果与直接测序的结果进行比较,计算其特异性和敏感性。结果:1.根据自行设计的引物和实验条件,成功地建立了扩增所有WD基因21个外显子、外显子/内含子交界区的方法。扩增产物大小与预期的结果相同,直接测序结果与基因库参照序列一致,证明引物设计正确,实验条件适当,实验可靠。2.检查32例WD患者ATP7B基因外显子,29例存在ATP7B基因外显子致病突变或多态,占90.63%,其中21例存在致病突变,占65.63%;在突变患者中,复合杂合突变17例,占53.13%;纯合突变4例(均为Arg952Lys,多态),占12.50%。3例未见任何突变及多态,占9.37%。ATP7B基因外显子突变以杂合突变为主,仅发现4例Arg952Lys纯合突变,占12.50%。3.共发现6种致病突变类型:①2号外显子994G→T(Glu332Ter)突变,6.25%;②8号外显子2333G→T(Arg778Leu)突变,突变频率40.63%;③12号外显子2828G→A(Gly943Asp)突变,突变频率3.13%;④13号外显子2975C→T(Pro992Leu)突变,突变频率3.13%;⑤16号外显子3532A→G(Thrl178Ala)突变,突变频率6.25%;⑥18号外显子3884C→T(Ala1295Val)突变,突变频率9.38%。其中994G→T,3532A→G,3884C→T 3种突变尚未见文献报道,为新发现的突变。共发现6种多态:①2号外显子1122C→G(Val374Val)突变,突变频率3.13%;②2号外显子1216T→G(Ser406Ala)突变,突变频率6.25%;③3号外显子1366G→C(Val456Leu)突变,突变频率6.25%;④8号外显子2310C→G(Leu770Leu)突变,突变频率40.63%;⑤12号外显子2855G→A(Arg952Lys)杂合突变,突变频率18.75%;12号外显子2855G→A(Arg952Lys)纯合突变,突变频率12.50%;⑥16号外显子3419T→C(Val1140Ala)突变,突变频率6.25%。其中2号外显子1122C→G突变尚未见文献报道,为新发现的多态。外显子1、4、5、6、7、9、10、11、15、17、19、20、21等未发现突变。4.虽然进行了全部外显子直接测序,仍有3例患者未发现任何突变,9例患者仅发现多态而没有致病突变。鉴于多例患者外显子未发现突变或仅有一个杂合突变,强烈提示外显子编码区以外的突变有引起肝豆状核变性可能。5.成功地建立了同时检测ATP7B基因8号外显子Arg778Leu突变和和12号外显子Arg952Lys突变的多重PCR反向杂交技术。固定于尼龙膜上的针对8号外显子突变位点及12号外显子多态位点的DNA探针与生物素标记引物的多重PCR扩增产物杂交后,如存在突变则在突变位点探针点样处可看到斑点显示,如无突变则在正常序列探针处有斑点显示。各种实验对照未出现假阳性和假阴性。6.用多重PCR反向杂交技术检测32例WD患者,13例患者第8外显子存在2333G→T杂合突变,6例患者第12外显子存在2855G→A杂合突变,4例存在2855G→A纯合突变,未出现假阳性和假阴性,与直接序列测定方法比较,其特异性和敏感性均为100%。结论:1.根据自行设计的引物和实验条件,成功地建立了肝豆状核变性基因21个外显子扩增和测序方法。2.在检查的32例WD患者中,29例存在ATP7B基因外显子致病突变或多态,占90.63%,其中21例存在致病突变,占65.63%;在突变患者中,复合杂合突变17例,占53.13%;纯合突变4例(均为Arg952Lys,多态),占12.50%。3例未见任何突变及多态,占9.37%。3.共发现6种ATP7B基因突变:9946→T(Glu332Ter),2333G→T(Arg778Leu),28286→A(Gly943Asp),2975C→T(Pro992Leu),3532A→G(Thrl178Ala),3884C→T(Ala1295Val),其中994G→T,3532A→G,3884C→T突变尚未见文献报道,为新发现的突变;发现6种多态,其中1122C→G突变尚未见文献报道,为新发现的多态。ATP7B基因外显子突变以杂合突变为主,仅发现4例Arg952Lys纯合突变,占12.50%。4.湖南地区肝豆状核变性基因突变以杂合、点突变为主,分布较分散。8号外显子Arg778Leu突变为湖南地区突变热点,占所检查患者的40.63%,其次为18号外显子Ala1295Val突变,占9.38%。5.鉴于多例患者外显子未发现突变或仅有一个杂合突变,强烈提示外显子以外的区域的突变有引起WD的可能。6.成功地建立了同时检测ATP7B基因8号外显子Arg778Leu突变和和12号外显子Arg952Lys突变的多重PCR反向杂交技术。7.用多重PCR反向杂交技术检测32例WD患者,与直接序列法测定的结果比较,特异性和敏感性均为100%。多重PCR反向杂交具有技术简单、快捷、敏感性高、特异性强的特点,在找出某地区突变热点的基础上,这一技术将在WD患者诊断、症状前患者筛选、产前胎儿诊断、WD遗传背景家族成员婚前检查等方面具有广阔的应用前景。