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背景虽然近年来针对对胰腺癌的诊断与治疗进行了大量的研究,但胰腺癌在所有肿瘤中的5年生存率排名仍然很低(约9%),因而仍是最为致命恶性肿瘤。由于约有半数的胰腺癌患者首诊时已出现远处转移导致无法行手术治疗,且化疗效果有限,使得治疗无法达到预期效果。所以寻找有效的胰腺癌治疗方法,提高胰腺癌病患生存质量,延长胰腺癌患者的生存期,对胰腺癌患者的预后存在巨大意义。研究发现约有80%的胰腺癌患者的癌前症状中存在空腹血糖升高或是糖尿病的表现,且在流行病学研究中发现,胰腺癌患者瘤体生长速度与血糖成正向线性关系,说明糖尿病对胰腺癌存在促进作用,其中的机制仍在探索之中,而控制血糖已成为胰腺癌综合治疗中的一个重要方法。近年来,上皮间充质转化被认为在肿瘤的发展过程中起到重要作用,当上皮来源的肿瘤细胞出具备了间质细胞表型后,肿瘤细胞间最为重要的粘附分子E-cadherin表达显著下调甚至出现丢失,从而使得肿瘤细胞的移动能力显著增加,导致肿瘤细胞侵袭和转移能力增强。目的1.明确不同浓度葡萄糖对胰腺癌细胞上皮间充质转化及细胞周期的影响,以及是否可通过改变PI3K-Akt通路蛋白表达导致胰腺癌细胞周期的改变。2.明确不同降糖药物对胰腺癌细胞上皮间充质转化的影响,以及对细胞周期相关调控因子蛋白表达和的PI3K-Akt通路蛋白表达的影响。实验方法在本研究中,我们共选取三株细胞株作为实验对象,分别为正常人胰腺导管上皮细胞H6c7和人胰腺导管上皮细胞癌细胞PANC-1,并通过转染制作获得存在K-ras突变的H6c7-K-ras细胞系。在研究过程中,我们将三种细胞系放入不同葡萄糖浓度的培养基中培养36小时后,流式细胞仪进行细胞周期检测,Western blot检测相关的重要标志分子E-cadherin、Vimentin、p53、p21、cdc2、Cyclin B1、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt在蛋白表达水平上的变化。在上述实验的基础上,将依据实验需要将不同浓度的胰岛素,二甲双胍、exendin-4(醋酸艾塞那肽)分别加入培养基中联合培养PANC-1细胞36h,重复上述Western blot实验内容。结果1、Western blot检测三种细胞在不同葡萄糖浓度时EMT相关标志分子的蛋白表达水平,结果表明对于三种细胞,高浓度葡萄糖对于E-cadherin和Vimentin分别存在抑制和促进表达作用,与H6c7细胞相比,H6c7-K-ras和Panc-1细胞产生上皮间充质转化的葡萄糖浓度更低。2、流式细胞仪检测三种细胞在不同葡萄糖浓度时细胞周期的变化,结果表明不同浓度的葡萄糖并未对H6c7的细胞周期产生影响(P>0.05)。而高浓度葡萄糖显著降低了H6c7-K-ras细胞和Panc-1细胞中G0/G1期细胞的比例(P<0.05),且同时增加G2/M期细胞的比例(P<0.05)。3、Western blot检测三种细胞在不同葡萄糖浓度时的细胞周期调控因子的蛋白表达水平。结果表明葡萄糖浓度对于H6c7细胞中p53,p21,cdc2和Cyclin B1的蛋白表达始无明显影响(P>0.05)。而高浓度葡萄糖显著降低H6c7-K-ras和Panc-1细胞中p53和p21的蛋白表达(P<0.05),同时增加cdc2和Cyclin B1的蛋白表达(P<0.01)。4、Western blot检测不同葡萄糖浓度培养条件下三种不同细胞系的PI3K-AKT信号通路的蛋白表达水平。结果表明,葡萄糖浓度未显著影响H6c7细胞中PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt的蛋白表达(P>0.05)。在H6c7-K-ras细胞中,葡萄糖浓度并不会影响PI3K的蛋白表达(P>0.05),但高浓度葡萄糖使Akt的蛋白表达升高(P<0.05),对p-PI3K、p-Akt的蛋白表达升高的更为显著(P<0.01)。在Panc-1中,高浓度葡萄糖可使其PI3K、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达出现升高(P<0.05),但对p-PI3K、p-Akt的作用更为显著(P<0.01)。5、Western blot检测经过胰岛素,二甲双胍和exendin-4作用后,高浓度葡萄糖培养环境中的Panc-1细胞EMT相关标志分子的蛋白表达水平。结果表明胰岛素和exendin-4对于E-cadherin和Vimentin的蛋白表达无显著影响。二甲双胍可促进E-cadherin的表达,同时抑制Vimentin的表达。6、Western blot检测经过胰岛素,二甲双胍和exendin-4作用后,高浓度葡萄糖培养环境中的Panc-1细胞周期调控因子的蛋白表达水平。结果表明,二甲双胍可升高p53的蛋白表达(P<0.05),同时降低cdc2和Cyclin B1的蛋白表达(P<0.05)。exendin-4可降低cdc2和cyclin B1的蛋白表达(P<0.05),对于p53和p21作用并不显著。而胰岛素抑制p53的蛋白表达(P<0.05),同时增加cdc2和cyclin B1的蛋白表达(P<0.05)。7、Western blot检测经过胰岛素,二甲双胍和exendin-4作用后,高浓度葡萄糖培养环境中的Panc-1细胞内PI3K-AKT信号通路的蛋白表达水平。结果表明所有药物均未对PI3K和Akt表达产生影响,但胰岛素可显著增加p-PI3K和p-Akt的蛋白表达(P<0.05),而二甲双胍和exendin-4则显著抑制p-PI3K和p-Akt的蛋白表达(P<0.05)。结论综上所述,高浓度葡萄糖可促进胰腺癌Panc-1细胞的上皮间充质转化,并通过上调PI3K-Akt信号通路相关蛋白的表达促进胰腺癌Panc-1细胞进入增殖周期。二甲双胍可抑制胰腺癌Panc-1细胞的上皮间充质转化,并上调p53蛋白表达,下调cdc2和cyclin B1的蛋白表达,同时抑制PI3K-Akt信号通路的蛋白表达。exendin-4对胰腺癌Panc-1细胞上皮间充质转化无明显作用,但可下调cdc2和cyclin B1的蛋白表达,且抑制PI3K-Akt信号通路的蛋白表达。而胰岛素未对胰腺癌Panc-1细胞的上皮间充质转化产生作用,但可下调p53的蛋白表达、上调cdc2和cyclin B1的蛋白表达,并且可促进PI3K-AKT信号通路的蛋白表达。