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目的:肥胖后微小核糖核酸（microRNAs,miRNAs）表达失调与2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM）的发生发展密切相关。寻找差异表达的miRNAs并探究其调控机体糖代谢的作用机理,将为阐明肥胖诱发T2DM的分子机制提供理论依据。本研究通过芯片技术结合生物信息学方法,筛选并验证与受试个体血糖相关的miRNAs及其下游靶基因;饲养脂肪组织特异性敲除Dicer酶小鼠,明确候选miRNAs是否来源于脂肪组织;体外培养HepG2、L02和3T3-L1细胞,以及构建饮食诱导肥胖小鼠模型,探讨候选miRNAs是否通过靶向抑制下游靶基因导致葡萄糖代谢障碍;最后,利用糖尿病小鼠模型初步评价候选miRNAs对T2DM的治疗作用。通过以上研究,尝试阐明肥胖诱发T2DM的可能分子机制,为T2DM的防治提供新的分子靶标。方法:1.受试个体差异表达miRNAs的筛选及验证（1）招募1053个受试个体,收集其一般资料、血清及基因组DNA样本,制作人类SNP微阵列芯片,筛选与受试个体血糖相关的miRNAs;（2）收集正常体重个体（n=36,18.5 kg/m~2≤BMI＜24 kg/m~2）,单纯性肥胖（n=36,BMI≥28 kg/m~2）及T2DM个体（n=12,空腹血糖≥7.0 mmol/L,或餐后2小时血糖≥11.1 mmol/L）血清及一般资料,分析血清候选miRNAs与受试个体一般资料及生化指标的相关性;（3）收集正常体重（n=6）和肥胖受试个体（n=6）腹部网膜脂肪组织,通过q RT-PCR技术检测脂肪组织中候选miRNAs的表达水平。2.体外细胞实验（1）运用Target Scan软件预测候选miRNAs的下游靶基因,基因功能分析筛选可能参与葡萄糖代谢调控的候选靶基因,并在细胞水平运用双荧光素酶报告基因实验,明确候选miRNAs对下游靶基因的调控作用;（2）体外培养HepG2、L02以及3T3-L1,上调/抑制候选miRNAs,检测对下游靶基因表达的影响,同时检测对葡萄糖转运蛋白4（Glucose Transporter 4,GLUT4）表达和细胞糖代谢能力的影响;（3）体外培养HepG2、L02以及3T3-L1,利用RNA干扰片段下调候选miRNAs下游靶基因,以及抑制候选miRNAs的同时下调下游靶基因,利用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测候选miRNAs下游靶基因以及GLUT4的m RNA及蛋白表达水平,同时检测对细胞糖代谢能力的影响。3.体内动物实验（1）饲养C57BL/6小鼠12只,分为普通饮食和高脂饮食,每组6只,持续喂养至第22周,动态监测小鼠一般资料;（2）构建脂肪组织特异性缺失Dicer酶小鼠模型（n=6）,高脂饮食喂养12周后,检测基因敲除鼠脂肪组织、肝脏和血清中候选miRNAs表达;（3）普通饮食饲养C57BL/6雄性小鼠20只,喂养16周后,分为对照组（n=10）和腹腔注射候选miRNAs mimic腺病毒载体组(n=10,1×1011VP/只/周,连续注射6周),动态监测小鼠一般资料;（4）高脂饮食饲养C57BL/6雄性小鼠20只,喂养16周后,分为对照组（n=10）和腹腔注射候选miRNAs inhibitor腺病毒载体组(n=10,1×1011VP/只/周,连续注射6周),动态监测小鼠一般资料;（5）喂养db/db鼠12只,适应性喂养1周后,分为对照组（n=6）和腹腔注射候选miRNAs inhibitor腺病毒载体组(n=6,1×1011VP/只/周,连续注射6周),动态监测小鼠一般资料;（6）通过血糖测试纸检测小鼠FBG;腹腔注射葡萄糖耐量及胰岛素耐量实验评价系统葡萄糖耐量和胰岛素敏感性;实验结束后进行眼眶取血,离心收集血清检测TG、TC、FFA、HDL-C和LDL-C含量;实时荧光定量PCR和Western Blot检测小鼠血清、肝脏及附睾白色脂肪组织中候选miRNAs和下游靶基因以及GLUT4的m RNA和蛋白表达水平。4.统计学方法统计分析使用SPSS 23.0（IBM SPSS Statistics version 23）进行。数据服从正态分布用t检验分析,非正态分布数据用非参数秩和检验,三组及以上使用单因素方差分析。P＜0.05为有统计学意义。结果:1.miR-548ab与受试个体FPG显著正相关,在肥胖及T2DM个体血清中含量增加,且在肥胖个体腹部脂肪组织中表达增加（1）对1053名受试者基因组DNA样本SNP微阵列芯片结果进行分析,并使用PLINK对注释的miRNAs进行全基因组关联分析后发现:58个miRNAs周围的550个突变与FPG显著相关,且与其它miRNAs相比,miR-548ab与血糖水平的相关性最为显著（P＜0.005）。（2）收集受试个体血清样本84例建立验证队列,比较血清miR-548ab含量后发现:与正常体重个体（n=36）相比,肥胖（n=36）及T2DM个体（n=12）血清中miR-548ab的含量显著增加,且与受试个体的FPG（r=0.304）显著正相关。（3）收集受试者腹部网膜脂肪组织,利用实时荧光定量PCR分析脂肪组织miR-548ab含量后发现:肥胖患者（n=6）腹部脂肪组织中miR-548ab的表达水平显著增加。差异有统计学意义,P＜0.05。2.饮食诱导的肥胖小鼠血清、肝脏和脂肪组织中miR-548ab显著高表达（1）与普通饮食小鼠（n=6）相比,高脂饮食喂养C57BL/6小鼠22周后,小鼠（n=6）的体重、Lee’s指数、肝脏和多种脂肪组织的重量显著增加,血清FPG、TG、TC、FFA和LDL-C含量显著增加,提示肥胖模型构建成功。肥胖小鼠附睾白色脂肪、肝脏和血清中miR-548ab表达显著增加。以上差异具有统计学意义,P＜0.05。（2）高脂饮食喂养12周后,与野生型小鼠（n=6）相比,脂肪组织特异性缺失Dicer酶小鼠（n=6）的脂肪组织、肝脏和血清中miR-548ab含量显著下降。以上差异具有统计学意义,P＜0.05。3.miR-548ab靶向抑制GULP1和SLC25A21的表达（1）运用软件Target Scan预测miR-548ab的下游靶基因后发现:参与葡萄糖代谢调控的GULP1和SLC25A21均具有miR-548ab的结合位点。（2）将GULP1和SLC25A21的3’UTR突变型（Mutation type,MUT）及野生型（Wild type,WT）荧光素酶报告基因质粒,与miR-548ab mimic共同转染至体外培养的HepG2细胞后发现:miR-548ab mimic可显著抑制WT GULP1和SLC25A21的3’UTR活性,对MUT GULP1和SLC25A21的3’UTR活性没有影响。以上差异具有统计学意义,P＜0.05。（3）与普通饮食小鼠相比,饮食诱导肥胖小鼠的肝脏和脂肪组织中GULP1、SLC25A21和GLUT4的蛋白水平显著降低。以上差异具有统计学意义,P＜0.05。4.miR-548ab可调控靶基因GULP1和SLC25A21的表达,影响HepG2、L02及3T3-L1细胞葡萄糖消耗能力（1）将50 nM、50 nM和70 nM的miR-548ab mimic分别转染至HepG2、L02和3T3-L1细胞24h后,与NC组相比,细胞中GULP1、SLC25A21和GLUT4的m RNA和蛋白表达被显著抑制。同时,过表达miR-548ab可显著降低HepG2、L02及3T3-L1细胞的葡萄糖消耗。差异有统计学意义,P＜0.05。（2）将100nM miR-548ab inhibitor分别转染至HepG2、L02和3T3-L1细胞24 h后,与NC组相比,细胞中GULP1、SLC25A21和GLUT4的m RNA和蛋白表达显著升高;同时,抑制miR-548ab可显著增强HepG2、L02及3T3-L1细胞的葡萄糖消耗。差异有统计学意义,P＜0.05。（3）为了验证GULP1和SLC25A21的功能,在HepG2和3T3-L1细胞中分别上/下调GULP1和SLC25A21的表达,可导致细胞中GLUT4的蛋白表达水平出现相应的升高/降低,细胞的葡萄糖消耗能力被显著促进/抑制。差异有统计学意义,P＜0.05。5.miR-548ab通过靶向下调GULP1和SLC25A21表达,抑制细胞GLUT4表达和葡萄糖消耗能力（1）与对照组相比,抑制miR-548ab后可显著促进HepG2、L02和3T3-L1细胞中GULP1、SLC25A21和GLUT4的表达,同时使细胞葡萄糖消耗能力增强;与单纯抑制miR-548ab组相比,抑制miR-548ab的同时分别下调GULP1或SLC25A21,可显著降低HepG2、L02和3T3-L1细胞GLUT4的m RNA和蛋白表达水平,同时显著逆转miR-548ab抑制剂对细胞葡萄糖消耗的促进作用。差异有统计学意义,P＜0.05。（2）与对照组相比,上调miR-548ab可显著抑制HepG2和3T3-L1细胞中GULP1、SLC25A21和GLUT4的表达,同时使细胞葡萄糖消耗能力增强;与单纯上调miR-548ab组相比,上调miR-548ab的同时分别上调GULP1或SLC25A21,可显著促进细胞GLUT4蛋白表达水平,同时显著逆转了miR-548ab mimic对细胞葡萄糖消耗的抑制作用。差异有统计学意义,P＜0.05。6.miR-548ab可通过调控脂肪及肝脏组织GULP1、SLC25A21和GLUT4表达,影响小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性（1）普通饮食喂养小鼠16周后,随机分为对照组和腹腔注射miR-548ab mimic腺病毒载体组,连续注射6周后,过表达组小鼠体重、肝脏及脂肪组织重量显著增加;肝脏和脂肪组织中miR-548ab的表达显著增加,GULP1、SLC25A21和GLUT4蛋白表达水平显著降低;小鼠血糖水平显著增加,葡萄糖耐量及胰岛素敏感性显著降低,TC、TG和LDL-C等血脂水平显著升高。差异有统计学意义,P＜0.05。（2）高脂饮食喂养小鼠16周后,随机分为对照组和腹腔注射miR-548ab inhibitor腺病毒载体组,连续注射6周后,抑制剂组小鼠体重、肝脏及脂肪组织重量显著降低,肝脏和脂肪组织中GULP1、SLC25A21和GLUT4蛋白表达水平显著升高,小鼠血糖、血脂水平显著降低,葡萄糖耐量及胰岛素敏感性显著升高。差异有统计学意义,P＜0.05。7.miR-548ab抑制剂可上调db/db小鼠肝脏和脂肪组织GULP1、SLC25A21和GLUT4表达,改善葡萄糖耐量及胰岛素敏感性持续给与db/db小鼠腹腔注射miR-548ab抑制剂腺病毒载体6周后,与对照组相比,小鼠体重、Lee’s指数、肝脏及脂肪组织重量显著降低;肝脏和脂肪组织中GULP1、SLC25A21和GLUT4蛋白表达水平显著升高;与对照组相比,小鼠血糖、血脂水平显著降低,葡萄糖耐量及胰岛素敏感性显著升高。差异有统计学意义,P＜0.05。结论:1.肥胖状态下脂肪组织源性的miR-548ab表达增加,与T2DM的发生发展密切相关。2.miR-548ab可通过靶向抑制肝脏及脂肪组织GULP1和SLC25A21表达,导致GLUT4表达降低,最终导致肝脏和脂肪组织糖代谢紊乱。