丝素肽的酶法制备及其生物活性的研究

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来源于蚕丝的丝素作为一种新型蛋白质资源,不但具有食用价值而且具有药用价值。我国蚕丝资源丰富,目前蚕种场因制种的需要,产生了大量的削口蚕茧,这种削口蚕茧多不能缫丝,通常被用作绢纺原料或加工丝绵,少数部分用于化妆品和医药品,经济价值偏低。鉴于此,本论文以削口蚕茧壳为原料,探讨了酶法水解丝素蛋白制备生物活性肽的可行性,揭示了反应条件对酶促丝素蛋白水解反应及其产物产率的影响规律,建立了丝素肽的前处理及酶法制备工艺;研究了酶解物丝素肽的生物活性及水解度等对丝素肽的生物活性的影响规律;主要研究内容如下:本文首先建立了丝素脱胶的工艺流程,采用Na2CO3溶液作分离介质,应用二次脱胶法使丝素的脱胶率达到22.80%。对原料蚕茧脱胶后得到的丝素蛋白进行了相关理化性质测定,结果表明本研究用丝素蛋白蛋白质含量高达94.58%;此外,脂肪含量为0.44%,水分含量为3.13%,总糖含量为0.66%,灰分含量为1.25%。其次,比较分析了六种微生物来源的蛋白酶对丝素蛋白水解反应的催化活性,确定丝素蛋白水解反应的最适水解酶为碱性蛋白酶Alcalse;探讨了不同水解反应条件对Alcalse催化丝素蛋白水解反应的影响规律;通过正交实验分析确定了丝素的最佳酶解条件为:底物浓度5%,加酶量1000U/g,反应温度60℃,反应pH8.5,反应时间240min,在该条件下通过控制反应时间可获得水解度为0-18.69%间的酶解物丝素肽。再次,通过体外实验研究了丝素肽包括ACE抑制活性、抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和抑菌活性在内的四种生物活性并探讨了反应水解度对所得产物丝素肽活性的影响特性。结果表明在水解度为17.12%时,丝素肽对ACE抑制率可达74.07%;在水解度为14.97%时,丝素素肽的抗氧化效果最好,此时丝素肽的ORAC值为30582.6μmol TE/g,对二苯代苦味酰基(DPPH·)的清除率为80.89%,对羟自由基(·OH)的清除率为71.23%;在水解度为16.08%时,丝素肽对α-葡萄糖苷酶具有最高抑制活性,可达44.90%;在水解度为18.69%时,丝素肽抑菌作用最强,对大肠杆菌和金黄色葡萄球进的抑制圈直径分别达到27mm和21mm。丝素肽的抑菌活性随浓度的增大而增强,呈正相关。通过最低抑菌浓度(MIC)实验测定,丝素肽(DH=18.69%)溶液对大肠杆菌的最低抑菌浓度为10mg/mL,对葡萄球菌的最低抑菌浓度也为10mg/mL。最后,对具有最高ACE抑制活性、抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和抑菌活性的四种丝素肽(DH=14.97%,16.08%,17.12%,18.69%)进行分子量分布分析及氨基酸组分分析。结果表明丝素肽含有丰富的氨基酸种类,其氨基酸组成与丝素蛋白类似。其中丝素肽中丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸含量相对较高。所研究的具有最高活性的四组丝素肽之间的分子量分布差异并不大,在0.6~2.4kDa间连续分布。本研究具有较高的理论研究价值,所得结论将极大丰富天然产物降解及天然活性肽制备等理论知识。同时,本研究还具有较强的实践作用,提供了一条制备新型生物活性肽的新方法,可有效高值利用我国丰富的蚕丝资源,提升丝素作为丝绸加工副产品的经济价值,有望产生较好的社会及经济效益。
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