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目的:通过缺氧培养方法预处理骨髓内皮祖细胞(BM-EPCs,bone marrow endothelial progenitor cells),探讨缺氧培养骨髓内皮祖细胞(BM-HEPCs,hypoxic preconditioned bone marrow endothelial progenitor cells)心肌内移植治疗缺血性心脏病的治疗效果及潜在的分子生物学机制,为临床细胞移植治疗缺血性心脏病提供理论依据和策略参考。内容:以BM-HEPCs为研究对象,观察缺氧培养方法对大鼠BM-EPCs细胞生物学功能的影响和潜在的分子生物学机制;研究基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α,Stromal cell-derived factor-1α)/CXCR4(CXCR4,CXC receptor-4)信号通路在BM-HPECs中发挥的作用;探讨BM-HPECs移植后对心室重构、心脏功能和血流动力学的影响;评估其对缺血性心脏病的治疗效果。方法:从8周龄,体重250g~280g的同种系成年雄性Wistar大鼠长骨分离获得大鼠BM-EPCs,Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac LDL,Dil-acetylated low-density lipoproteins)和异硫氰酸盐荧光素标记的荆豆凝集素-1(FITC-UEA-1,fluorescein isothiocyanate-lectin from ulex europaeus-1)共同染色阳性,细胞表面白细胞分化抗原34(CD,cluster of differentiation)/CD133表达阳性。将37℃、5%CO2+21%O2条件下培养至第4天的BM-EPCs,随机分为4组,第一组为常规培养组,37℃、5%CO2+21%O2条件下继续培养3天;第二组为缺氧培养24h组,37℃、5%CO2+21%O2条件下继续培养2天后,放入存满1%O2+5%CO2+94%N2混合气体的培养盒内继续培养1天;第三组为缺氧培养48h组,37℃、5%CO2+21%O2条件下继续培养1天后,放入存满1%O2+5%CO2+94%N2混合气体的培养盒内继续培养2天;第四组为缺氧培养72h组,放入存满1%O2+5%CO2+94%N2混合气体的培养盒内继续培养3天,对以上各组细胞分别进行抗凋亡检测(Annexin V/PI),细胞迁移实验(Boyden Chamber Assay),血管分化功能检测(Matrigel Assay),实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR,reverse transcriptase-polymerase chain reaction)检测CXCR4,磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT,serine/threonine-specific protein kinase),磷脂酰肌醇3激酶(PI3K,phosphatidyl Inositol 3-kinase)和核因子-κB(NF-κB,nuclear factor-κB)信使核糖核酸(m RNA,Messenger Ribonucleic Acid)表达水平,应用蛋白印迹实验(Western Blot)检测细胞表面SDF-1α受体CXCR4,Akt,PI3K蛋白表达情况。比较各组细胞生物学功能变化差异。8周龄,体重250g~280g的同种系成年雄性Wistar大鼠34只,随机分为3组:对照组(Control,n=12),EPCs组(n=10)和HEPCs组(n=12),左心耳下缘2mm处结扎前降支,建立急性心肌梗塞动物模型。Control组:在心肌梗塞边缘5个不同区域心肌内注射PBS溶液200μl;EPCs组:将2×106常规培养内皮祖细胞稀释于200μl PBS溶液中,在心肌梗塞边缘5个不同区域心肌内注射移植;HEPCs组:将2×106缺氧培养24h骨髓内皮祖细胞稀释于200μl PBS溶液中,在心肌梗塞边缘5个不同区域心肌内注射移植。4周后心脏超声检测心脏的形态学变化,压力-容量曲线(P-V Loops,pressure-volume loops)分析评估实验动物血流动力学和心脏功能变化。结果:BM-EPCs随培养时间延长,圆形或椭圆形细胞数目减少,梭形细胞数量增多,更换培养基后培养1天时出现细胞集落,3天开始出现内皮细胞特异性条索状结构。分离培养至第7天的大鼠BM-EPCs,Dil-ac LDL和FITC-UEA-1双荧光染色细胞阳性,CD34/CD133表达阳性。随缺氧处理时间延长,BM-EPCs早期凋亡率明显增加。与常规培养组相比,缺氧培养24 h组早期凋亡率改变不明显(p>0.05),缺氧培养48 h组、72 h组,早期凋亡率明显增加(p<0.05)。以100ng/ml SDF-1α为趋化因子,比较常规条件和缺氧条件培养BM-EPCs的迁移能力,结果显示缺氧培养24h组,大鼠BM-EPCs对SDF-1α的迁移明显增加。随缺氧处理时间的延长,BM-EPCs体外血管形成能力变化明显。与常规培养组比较,缺氧培养24 h组的体外血管形成能力增强(p<0.01),缺氧培养48 h,72 h组体外血管形成能力明显下降(p<0.01);与缺氧培养24 h组比较,缺氧培养48 h,72 h组体外血管形成能力明显下降(p<0.05)。RT-PCR结果显示,与常规培养组相比较,缺氧培养24h组CXCR4,AKT,PI3K和NF-κB表达均具有显著差异(p>0.05)。缺氧培养大鼠骨髓内皮祖细胞24h,48h,72h后,Western Blot蛋白印迹实验显示,细胞表面SDF-1α受体CXCR4表达水平增高,细胞内相关通路蛋白AKT,PI3K表达水平增高。应用Image J图像处理软件获得蛋白印迹图像密度灰度值进行统计分析,结果提示缺氧培养大鼠骨髓内皮祖细胞24h,48h,72h后,CXCR4,AKT,PI3K表达水平与普通培养组相比明显增加,缺氧培养24h组与缺氧培养48h和72h相比较,蛋白表达增强,结果具有统计学意义。实验动物细胞移植后4周,评估心脏形态及血流动力学指标。EPCs组左室舒张末期直径和收缩末期直径与对照组相比在移植后显著下降(p<0.05),而最大压力、左室内压与左室内压变化速率比(d P/dtmax,the maximum first derivative of developed left ventricle pressure),左室容量与左室容量变化速率比(d V/dtmax, the maximum first derivative of developed left ventricle volume),心搏量和每分输出量以及射血分数则明显提高(p<0.05)。相比之下,HEPCs组左室舒张末期容积和收缩末期容积与对照组相比在移植后同样下降明显,且最大压力、d P/dtmax,d V/dtmax,心搏量和每分输出量以及射血分数则明显提高。此外,HEPCs组左室收缩末期直径与EPCs组相比下降明显,最大压力、d P/dtmax,左室射血分数则明显提高。结论:1%O2+5%CO2+94%N2缺氧培养大鼠BM-EPCs 24h为缺氧预处理的最佳条件,缺氧培养骨髓内皮祖细胞上调细胞表面CXCR4,通过SDF-1α/CXCR4轴,PI3K/Akt细胞信号通路介导骨髓内皮祖细胞增强发挥细胞生物学功效。HEPCs与EPCs相比,对缺血性心脏病的治疗效果更加明显,限制了心室重构,改善梗塞后心脏整体心脏功能,是更为有效的细胞移植治疗方法。优化了骨髓内皮祖细胞的治疗策略,提高了治疗效率。