【摘 要】
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目的基于天然噬菌体纳米抗体展示库,筛选针对抗人表皮生长因子受体2（HER-2）纳米抗体序列,与人Ig G1 Fc片段偶联通过原核表达系统表达并进行纯化后,对重组抗HER-2纳米抗体的生物学功能进行初步验证。方法1.抗HER-2纳米序列筛选采用生物素-链霉亲和素液相筛选法,在天然噬菌体纳米抗体展示库中筛选抗HER-2纳米抗体,经过三轮筛选后随机挑取单个菌落进行phage-ELISA鉴定,并取阳性单克
【基金项目】
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2020年宁夏回族自治区重点研发计划重点项目,项目名称:抗肿瘤基因工程纳米抗体药物的研发,项目编号:2020BFG02017；
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目的基于天然噬菌体纳米抗体展示库,筛选针对抗人表皮生长因子受体2（HER-2）纳米抗体序列,与人Ig G1 Fc片段偶联通过原核表达系统表达并进行纯化后,对重组抗HER-2纳米抗体的生物学功能进行初步验证。方法1.抗HER-2纳米序列筛选采用生物素-链霉亲和素液相筛选法,在天然噬菌体纳米抗体展示库中筛选抗HER-2纳米抗体,经过三轮筛选后随机挑取单个菌落进行phage-ELISA鉴定,并取阳性单克隆菌液进行测序。2.合成重组抗HER-2纳米抗体利用基因合成技术将获得的抗HER-2纳米抗体序列与人Ig G1 Fc片段偶联,将重组抗HER-2纳米抗体序列克隆至原核表达载体pET-30a,转化至表达菌Arctic Express,IPTG诱导重组抗HER-2纳米抗体的表达并通过Ni柱进行亲和纯化。3.重组抗HER-2纳米抗体生物学功能的验证对重组抗HER-2纳米抗体,采用Western Blot实验鉴定特异性,SPR技术检测亲和力,细胞免疫荧光实验验证其在体外与SKBR-3细胞的结合,并通过CCK-8实验分析其对SKBR-3细胞增殖的抑制作用。结果1.测序后获得了一条抗HER-2纳米抗体基因序列,经比对与驼源重链抗体具有较高的一致性。在Ex PASy网站对其理化性质进行初步分析,分子量为13.32k Da,总平均亲水性为-0.371。2.成功构建了原核表达载体pET-30a-HER-2-人Ig G1 Fc,转化至大肠杆菌Arctic Express中加入IPTG诱导后,发现目的蛋白主要表达于包涵体中,且经纯化后获得的重组抗HER-2纳米抗体纯度高于90%,浓度为0.15μg/μL。3.Western Blot实验表明重组抗HER-2纳米抗体可与HER-2抗原特异性结合,经SPR技术检测其亲和力为9.34μM,细胞免疫荧光实验结果提示其可与SKBR-3细胞表面的HER-2分子结合,且CCK-8实验显示SKBR-3细胞存活率与重组抗HER-2纳米抗体作用时间及作用浓度有关,具有剂量依赖性（P＜0.05）。结论1.基于天然噬菌体纳米抗体展示库,以生物素化HER-2抗原为靶点,经过三轮筛选后,成功获得了一条抗HER-2纳米抗体基因序列。2.将抗HER-2纳米抗体序列与人Ig G1 Fc片段偶联后,通过原核表达系统进行表达并纯化,获得了高纯度的重组抗HER-2纳米抗体。3.重组抗HER-2纳米抗体对HER-2抗原特异性和亲和力良好,可以和表达HER-2的SKBR-3细胞结合,并且对SKBR-3细胞的增殖具有抑制作用。
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