[背景]牙周炎主要是由牙周致病菌诱导的牙周组织的急、慢性炎症,并导致软组织和牙槽骨组织的破坏。传统的非手术或外科治疗,多以控制炎症为主,难以重建天然牙周组织。而组织工程与再生医学研究中,可诱导间充质干细胞（MSCs）分化为成骨细胞（OB）,进而生成牙槽骨。但在牙周炎症环境中,炎性细胞所分泌的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,可改变MSCs增殖分化能力,从而抑制其组织再生功能,最终造成牙周组织缺损难以修复。那么如何阻断TNF-α对MSCs的作用,促进其成骨分化就成为治疗牙周炎骨缺损的关键。值得注意的是,TNF-α刺激MSCs后,其WW域E3泛素蛋白连接酶1（WWP1）的表达升高。而WWP1是一种多功能蛋白,它可以促进Runx2和JunB的多聚泛素化和蛋白酶体依赖性降解,进而抑制细胞成骨分化的能力。体外实验证实,通过RNA干扰（RNAi）技术沉默WWP1基因后,炎性MSCs的成骨相关基因（ALP、OCN）表达升高。在牙周组织中,存在一定数量的牙周膜干细胞（PDLSCs）。该细胞具有高度增殖、自我更新和分化潜能,并在牙周组织再生修复过程中发挥重要功能。这提示我们,可以通过RNAi技术,利用小干扰RNA（siRNA）具有靶向、特异及高效性的特点,沉默炎性PDLSCs的WWP1基因,以实现促进牙周骨组织再生的目的。RNAi技术体内应用的最大障碍在于siRNA易降解、细胞摄取率低,缺乏组织靶向性。因此,siRNA的递送往往都依赖于转染试剂即载体的协助。不幸的是,常见的载体合成技术复杂,价格昂贵,并且具有较高的细胞毒性,很难用于体内实践。因此,降低siRNA载体材料的毒性、免疫原性和成本是RNAi技术从实验室向临床过渡的关键因素。最近,钙离子（Ca2+）作为一种新的、可替代的siRNA递送材料引起了人们的关注。然而,不同类型细胞对Ca2+浓度的耐受性不同,这限制了其在体内的应用。而牛血清白蛋白（BSA）可通过螯合作用与Ca2+结合。此外,BSA具有良好的生物相容性,是纳米颗粒的良好涂层材料。因此,我们假设用BSA涂层优化Ca2+-siRNA后有助于缓冲体内Ca2+毒性。基于以上研究背景,我们提出本课题的设计思路:首先观察TNF-α对PDLSCs功能影响的基础上,证明WWP1对PDLSCs成骨分化的影响。其次构建一种成本低廉、便捷高效及安全可靠的基因载体,与siRNA形成转染复合物。然后对该转染复合物的生物相容性及转染特性进行研究。最后引入WWP1 siRNA评价其体内外促成骨的作用。为RNAi技术治疗牙周炎的骨组织缺损提供新思路。第一部分 TNF-α对牙周膜干细胞生物学行为的影响[目的]分离培养PDLSCs,进行表型鉴定,观察TNF-α对其生物学行为的影响,构建GFP-PDLSCs 细胞株。[方法]1、采用组织块培养法进行PDLSCs原代培养,流式细胞仪检测其表面标记物。2、通过组织学染色及RT-PCR检测,观察分析TNF-α对PDLSCs多向分化能力的影响。3、慢病毒载体加载含eGFP基因序列的质粒,并转染PDLSCs,使其过表达GFP。[结果]1、PDLSCs形似成纤维细胞,呈长梭形,圆形细胞核位于中央;PDLSCs均表达MSCs的表面标志物,即CD29、CD44、CD90、CD105和CD146阳性,CD34和CD45阴性。2、15 ng/mLTNF-α可抑制PDLSCs的多向分化能力;成骨诱导过程中,TNF-α可上调PDLSCs中WWP1的表达,下调ALP、OCN的表达。3、在MOI为80的感染条件及1μg/mL Puromycin的筛选条件下,可获得荧光率达90%以上的GFP-PDLSCs稳定细胞株。[结论]1、PDLSCs具有MSCs的高度增殖、自我更新和分化潜能等特征,但在15 ng/mL TNF-α的刺激下,其多向分化能力受到抑制。2、TNF-α通过诱导PDLSCs WWP1表达升高,以及ALP、OCN表达降低,进而抑制其成骨分化能力。第二部分 BSA-Ca2+-siWWP1的构建及表征研究[目的]构建BSA-Ca2+-siRNA,并筛选出高稳定性和负载率的BSA/Ca2+/siRNA 比值。[方法]1、通过扫描电子显微镜、原子力显微镜、粒径分析仪进行复合物的表征研究。2、通过傅里叶红外光谱分析（FTIR）、等热滴定量热（ITC）、分子模拟对接分析复合物的结合方式。3、通过琼脂糖凝胶电泳仪、紫外分光光度计评价复合物的稳定性及溶解度。[结果]1、BSA、Ca2+和siRNA可结合形成直径为139.4±23.9 nm的球形颗粒,且表面较为粗糙,带有4.72±0.37 mV电荷。2、FTIR显示BSA-Ca2+-siRNA结构中C-C或C-N伸缩峰数目最多,且3430、2358和2155 cm-1处的峰值最强;ITC显示BSA-Ca2+-siRNA的解离常数Kd约9.80 mM;siRNA与BSA-Ca2+上的3个Ca2+有直接的相互作用,形成的复合物结构稳定。3、当BSA浓度≥ 500μg/mL时,BSA-Ca2+-siRNA纳米复合物能够牢固地保留和保护siRNA货物;其在中性或酸性PBS中siRNA的释放率分别为48%、64%。[结论]1、BSA-Ca2+-siRNA纳米复合物是一种纳米级的球形颗粒,且Ca2+作为桥体将BSA、siRNA连接在一起,其结合能较强。2、BSA-Ca2+-siRNA纳米复合物具有较高的稳定性,并可实现持续的siRNA释放,且在酸性环境中,其降解效率更高。第三部分 BSA-Ca2+-siRNA的转染特性及生物安全性分析[目的]评价BSA-Ca2+-siRNA纳米复合物的转染效率、细胞摄取途径和胞内释放途径,并进行生物安全性分析以探究其临床治疗潜力。[方法]1、使用倒置荧光显微镜、流式细胞仪观察分析BSA-Ca2+-siRNA的转染效率。2、使用激光共聚焦显微镜、倒置荧光显微镜、流式细胞仪观察分析BSA-Ca2+-siRNA的细胞摄取、胞内释放途径。3、通过CCK-8法评价BSA-Ca2+-siRNA的细胞毒性;通过体内注射实验及溶血实验分析该纳米复合物的生物相容性。[结果]1、BSA-Ca2+-siRNA纳米复合物可被PDLSCs摄取,产生RNAi效应,其转染效率优于 Lipofectamine 2000（Lipo）。2、BSA-Ca2+-siRNA纳米复合物可通过网格蛋白介导的内吞作用、小窝蛋白依赖的内吞作用以及巨胞饮作用进入PDLSCs,其中以巨胞饮作用为主;其主要通过内体/溶酶体的酸化进行siRNA的胞内释放。3、当BSA浓度≥ 500μg/mL时,BS A-Ca2+-siRNA纳米复合物对PDLSCs及肌细胞具有较高的生物相容性;当BSA浓度≥ 5000 μg/mL时,BSA-Ca2+-siRNA纳米复合物未使红细胞产生明显的血红蛋白渗漏现象。[结论]1、BSA-Ca2+-siRNA纳米复合物可实现siRNA的高效转染,待siRNA释放后,到达细胞内特定位置,产生RNAi效应,并显著下调靶基因的表达。2、BSA涂层可改善Ca2+-siRNA纳米颗粒的生物相容性。第四部分BSA-Ca2+-siWWP1对牙周膜干细胞成骨分化的影响[目的]探究BSA-Ca2+-siWWP1纳米复合物的体外成骨功效,为后续的体内研究提供实验基础。[方法]1、通过组织学染色观察及半定量分析评价BSA-Ca2+-siWWP1纳米复合物促成骨作用。2、通过RT-PCR及Western blot检测分析siWWP1促成骨作用的机制。[结果]1、BSA-Ca2+-siWWP1纳米复合物可促进PDLSCs ALP与OCN的分泌、COL-1的合成以及ECM的矿化。2、沉默WWP1后,PDLSCs的ALP、OCN及Runx2的mRNA表达显著上调,但JunB的mRNA表达无明显改变。[结论]BSA-Ca2+-siWWP1纳米复合物能够发挥RNAi作用,沉默WWP1的表达,提高Runx2的表达,并增强ALP及OCN的合成、COL-1的分泌和ECM的矿化,进而显著促进PDLSCs体外成骨分化。第五部分BSA-Ca2+-siWWP1对牙周炎组织缺损模型骨再生的作用[目的]分析BSA-Ca2+-siRNA纳米复合物在体内的促成骨效应,为RNAi技术应用于牙周炎及其它疾病的治疗提供研究依据和新思路。[方法]1、通过LPS注射及细线结扎的方法构建牙周炎骨组织缺损动物模型,并通过Micro-CT影像学观察评价动物模型的骨破坏及自愈情况。2、使用Cy-5.5标记siRNA,通过活体成像系统评估BSA-Ca2+-siRNA纳米复合物在体内的稳定性及有效期。3、通过组织学染色及Micro-CT影像学观察分析BSA-Ca2+-siWWP1纳米复合物的体内促成骨作用。[结果]1、造模28 d后,牙槽骨高度降至根尖1/3处,大鼠牙周炎骨组织缺损模型构建成功;模型祛除炎性因子15 d后可观察到明显新骨形成,30 d后可自愈。2、BSA-Ca2+-siRNA组大鼠体内的荧光信号可存在4d之久;而Lipo-siRNA组及裸siRNA组在3 d后无明显荧光信号。3、Micro-CT扫描重建并分析,BSA-Ca2+-siRNA组大鼠实验牙CEJ-ABC的骨高度保持较对照组更优,根分叉处牙槽骨体积均较对照组有明显提高;组织学染色可见BSA-Ca2+-siRNA组大鼠实验牙周围有更多的新骨形成,且骨组织致密、连续。[结论]1、LPS注射配合细线结扎的方法可快速构建大鼠牙周炎骨组织缺损模型,且该模型可在30 d后自愈。2、BSA-Ca2+-siWWP1纳米复合物在大鼠牙周组织内可实现长达4 d的siRNA释放。3、BSA-Ca2+-siWWP1纳米复合物对大鼠牙周炎骨组织缺损模型具有良好的促成骨作用。