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本研究拟以C57BL/6小鼠Lewis肺癌细胞株3LL建立肿瘤动物模型,从体内和体外探讨GM-CSF转染的肿瘤疫苗3LL-GM是否能够通过诱导增强的抗肿瘤免疫应答,最终使得巨大肿瘤完全消退。更进一步,通过对肿瘤细胞3LL-GM的肿瘤抑癌基因TSLC1表达检测和由其免疫后诱导的树突状细胞亚群比例和功能测定,对3LL-GM肿瘤疫苗的作用机制进行探讨,为临床应用GM-CSF肿瘤疫苗提供新的理论基础和实验依据。
第一部分 3LL-GM荷瘤小鼠的肿瘤自发性完全消退
3LL-GM是以lentivirus载体转染小鼠GM-CSF基因的3LL细胞株,我们以其作为细胞因子基因转染获得的全瘤活细胞疫苗,希望能够藉此获得特异性抗肿瘤效应。
以3LL-GM为实验组,以母本3LL和转染空lentivirus载体的3LL-GFP为对照组,在小鼠右侧腹股沟皮下注射5×1053LL、3LL-GFP或3LL-GM,每2-3天测量肿瘤大小,观察荷瘤小鼠生存情况。
为排除3LL-GM荷瘤小鼠的肿瘤完全消退是由于GM-CSF基因的转入导致的肿瘤生长特性改变所致,我们对3LL-GM在体内与体外的生长特性进行了检验。我们首先观察了普通体外细胞培养条件下的细胞生长曲线,发现3LL、3LL-GFP或3LL-GM三株细胞的生长速率一致,可见GM-CSF的转入没有影响细胞本身的体外生长特性。体内,我们采用缺乏T淋巴细胞的裸鼠进行3LL、3LL.GFP和3LI.-GM成瘤实验。将5×1053LL、3LL-GFP和3LL-GM分别接种于裸鼠右腹股沟皮下,观测肿瘤生长情况。
进一步,以各淋巴细胞亚群的特异性抗体体内阻断T淋巴细胞的功能,寻找在3LL-GM诱导的荷瘤小鼠肿瘤消退中起关键作用的T细胞亚群。结果发现,用同型抗体处理的对照组荷瘤小鼠的肿瘤发生消退,全部小鼠长期存活；而在用抗CD8抗体去除相应的CD8+T淋巴细胞亚群的情况下,小鼠的肿瘤消退现象消失,呈现进行性生长,直至小鼠死亡,提示CD8+T细胞在3LL-GM的抗肿瘤效应中起了决定性作用。
第二部分 3LL-GM肿瘤疫苗诱导增强的特异性抗肿瘤免疫效应
承接上一部分的研究,我们在这部分中主要关注3LL-GM肿瘤疫苗在C57BL/6小鼠体内诱生的特异性免疫应答及效应。
首先,以流式细胞术观察小鼠各淋巴细胞亚群的比例变化,发现在3LL-GM组小鼠的CD3+的脾脏T淋巴细胞中,CD8+T细胞比例为51.02％,显著高于3LL组的39.43％和3LL-GFP组的36.90％。以CD62Llow作为代表淋巴细胞活化、效应的标志,检测了3LL-GM肿瘤疫苗接种对小鼠淋巴细胞活化状态的影响。结果显示,3LL-GM组小鼠脾脏CD3+CD62Llow细胞比例为2.73％,高于3LL组的1.73％和3LL-GFP组的1.59％,表明3LL-GM诱导机体T淋巴细胞处于活化和效应状态。由于机体内发挥抗肿瘤免疫效应的主要是CD8+T细胞,我们又检测了脾脏淋巴细胞中CD8+CD62Llow细胞的比例,发现这群细胞在3LL-GM组小鼠为1.18％,高于3LL组的0.70％和3LL-GFP组的0.58％。可见,3LL-GM诱导小鼠产生系统性的CD8+T细胞应答以及淋巴细胞活化。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞是一群具有免疫抑制功能的T细胞,在维持免疫耐受,抑制免疫应答方面发挥重要作用。在肿瘤免疫中,CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞调控肿瘤免疫应答,参与肿瘤的发生发展过程。
接着,我们体外检测3LL-GM荷瘤小鼠诱生的细胞免疫应答。荷瘤第8天小鼠脾淋巴细胞在体外以3LL细胞裂解液刺激,48小时后检测特异性淋巴细胞的增殖活性。结果显示:3LL-GM组淋巴细胞对3LL的特异性增殖显著高于3LL组和3LL-GFP组(刺激指数SI值8.80 vs 3.84,2.72),表明3LL-GM荷瘤小鼠的免疫细胞诱导并显著增强抗3LL肿瘤细胞的特异性细胞免疫应答。
进一步检测增强的3LL肿瘤特异性细胞免疫应答是否诱生增强的抗肿瘤效应。以流式细胞术对CD8+T细胞内细胞因子IFN-γ分泌检测发现,3LL-GM组小鼠CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力优于3LL组和3LL-GFP组小鼠分泌IFN-γ的CD8+T细胞(0.25％ vs 0.12％,0.10％),提示3LL-GM实验组诱生更多CD8+T效应细胞被活化。小鼠体内的IFN-γ分泌也获得相同的结果。荷瘤第8天,3LL-GM组小鼠血清中IFN-γ浓度为4586.06pg/ml,与3LL组的320.49pg/ml相比,有统计学差异。更重要的是,在肿瘤局部,3LL-GM组小鼠肿瘤组织中IFN-γ的含量为39.12ng,显著高于3LL组的2.18ng,充分表明3LL-GM组在肿瘤局部诱生了具有显著杀伤效应的CD8+T细胞,非常有利于对肿瘤细胞的杀伤。
同时,我们以ELISA方法研究3LL-GM实验组对荷瘤小鼠Th1/Th2免疫格局的影响,收获的荷瘤小鼠淋巴细胞体外培养12h后,检测其上清中IFN-Yγ和IL-4的含量。结果显示:3LL-GM组上清中的IFN-γ明显高于3LL组和3LL-GFP组(1408.97pg/ml vs 68.19pg/ml,53.80pg/ml),具有显著的统计学差异；而三组间IL-4的含量则无明显差异,表明3LL-GM肿瘤疫苗诱导的是Th1型应答。
第三部分 3LL-GM肿瘤疫苗抗瘤效应的可能机制研究
在这一部分中,我们探讨了3LL-GM肿瘤疫苗抗瘤效应的可能机制。
首先,从分子和细胞水平对3LL、3LL-GFP和3LL-GM细胞株GM-CSF的表达及分泌进行了检测。RT-PCR和PCR结果显示,在mRNA水平,仅有3LL-GM表达GM-CSF。细胞培养上清ELISA结果显示,3LL-GM分泌的GM-CSF为234.20ng/106/24h,而3LL和3LL-GFP不分泌GM-CSF,表明我们所培养的3LL-GM可以稳定分泌GM-CSF。
对小鼠体内GM-CSF的表达情况进行了动态观察。3LL-GM组小鼠血清中GM-CSF浓度随肿瘤面积增长而上升,至肿瘤面积最大的荷瘤第8天,GM-CSF浓度达到最高,为1830.293pg/ml,而后又随肿瘤消退过程而逐渐消失,而3LL荷瘤小鼠血清中始终未能检测到GM-CSF。尤其是在肿瘤局部,3LL-GM组荷瘤小鼠的肿瘤组织表达高剂量的GM-CSF,荷瘤第8天最高,其匀浆液中含GM-CSF565.26ng/g肿瘤组织；3LL肿瘤匀浆液中仅含GM-CSF 0.50ng/g肿瘤组织,可能为肿瘤局部浸润的免疫细胞所分泌。
GM-CSF在3LL-GM肿瘤局部的高浓度存在,有利于促进DC成熟促进特异性抗肿瘤免疫。I-Ab和CD80的高表达是DC成熟的标志,对各组小鼠脾脏和TILs中DC成熟度进行检测,结果显示,脾脏中,CD11c+I-Ab+细胞在3LL-GM组为20.05％,显著高于3LL组的7.98％和3LL-GFP组的11.16％；CD80+细胞则为25.44％,显著高于3LL组的4.80％和3LL-GFP组的18.81％。3LL-GM组的TILs中,CD11c+I-Ab+细胞达60.62％,显著高于3LL组的33.12％和3LL-GFP组的19.98％；CD80+细胞则为60.93％,高于3LL组的37.47％和3LL-GFP组的47.03％。这些结果都提示3LL-GM肿瘤疫苗能诱导全身特别是肿瘤局部DC的成熟。
已知成熟DC有不同亚群,根据CD4和CD8α的表达情况,DC至少可被分为3个亚群,即CD8α+CD4-、CD8α-CD4+和CD8α-CD4-。有研究发现,CD8α+CD4-的DC能在体内激活CTL。我们对3LL-GM肿瘤疫苗诱导的DC亚群进行了分析,结果显示,3LL-GM组的CD11c+CD8α+CD4-细胞比例显著升高,特别是在肿瘤组织局部,高达55.35％,提示在3LL-GM肿瘤疫苗诱导的强烈的CD8+T细胞应答中,CD8α+CD4-这一DC亚群比例的升高可能起了至关重要的作用。
已知DC分泌IL-12的能力与其诱导Th1型应答有关。将DC体外培养后检测上清中IL-12p40的含量,发现3LL-GM组小鼠IL-12p40的分泌量为415.23pg/ml,与3LL组的142.53pg/ml和3LL-GFP组的156.98pg/ml相比有显著性差异,说明3LL-GM肿瘤疫苗能诱导DC的功能增强。
除了3LL-GM肿瘤疫苗诱导肿瘤局部微环境改变,促使DC成熟和诱导CD11c+CD8α+CD4-亚群以外,我们也尝试探索了3LL-GM肿瘤本身生长特性的改变情况。
TSLC1是一种最早发现于肺腺癌细胞株A549的抑癌基因,与肿瘤的侵袭能力及死亡率有关。我们对3LL、3LL-GFP和3LL-GM的TSLC1基因表达进行了检测。RT-PCR和PCR方法显示,3LL-GM在mRNA水平有高水平的TSLC1表达,3LL和3LL-GFP则无。提示GM-CSF的转入可能引起与肿瘤消退相关的基因表达的改变。
进一步对肿瘤原位的凋亡情况进行检测。在小鼠接种3LL或3LL-GM的第5天、第8天、第10天处死小鼠,取新鲜肿瘤组织固定后用TUNEL的方法进行了检测,发现:3LL和3LL-GM肿瘤内的肿瘤细胞凋亡都随接种时间而逐渐增加,3LL-GM瘤内的瘤细胞在接种第10天凋亡显著。