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研究背景胶质细胞源性神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF),广泛存在于神经系统,并对中枢神经系统和周围神经系统多类神经元的存活,营养,突起生长及分化具有重要的作用,是迄今发现对多巴胺神经元和脊髓运动神经元营养作用最强的营养因子。众多对帕金森氏病动物模型研究以及帕金森氏病病人观察表明,纹状体和黑质中GDNF的增多能够部分挽救损坏的多巴胺能神经元,并且促进运动神经元功能的恢复。因此,GDNF被认为对帕金森氏病等神经退行性疾病具潜在疗效。目前,国外生物制药公司已有使用GDNF治疗帕金森氏病的临床试验。成熟的GDNF以分泌蛋白的形式释放到胞外,以同源二聚体形式同膜表面受体复合体结合,从而激活一系列下游信号通路,完成信号转导。通常,受体复合体包括两分子的单跨膜酪氨酸激酶受体RET和两分子的甘油磷酸肌醇(GPI)锚定细胞表面蛋白GFRα。同脑源神经营养因子BDNF,神经生长因子NGF一样,最初合成的GDNF包含一段pro-domain,最终,GDNF以不含pro-domain的成熟形式释放到胞外。细胞中GDNF的分泌分为不受外界信号影响持续的组成型分泌和受到生理刺激后产生的调节型分泌。我们之前研究证实, pro-domain缺失78碱基GDNF异构体GDNFA78调节型分泌存在缺陷,提示pro-domain在GDNF的分泌中可能发挥重要的调控作用。然而,关于GDNF分泌调控的分子机制目前研究的还不是很清楚。分选蛋白受体SorLA (Sorting protein-related receptor SorLA)——VPS10P受体家族的一员—一在神经系统中广泛分布。除了少量分布在膜表面外,大部分SorLA聚集在高尔基体,发挥蛋白分选功能。之前有研究证实,SorLA同GDNF存在相互作用,然而,SorLA对GDNF的生物学功能产生怎样的影响,以及是如何产生的,需要进一步探究。研究目的1)进一步明确SorLA和GDNF的相互作用；2)寻找参与GDNF分泌调控的关键蛋白：深入研究SorLA在GDNF分泌中的作用；3)阐释两分子之间的作用机制；实验方法免疫共沉淀、western blot检测GDNF、SorLA蛋白相互作用PC12细胞共转带HA标签的GDNF和Flag标签的SorLA,48小时后,收集细胞裂解液,取部分直接加sample buffer煮沸,剩余部分加HA抗体polyHA低温孵育,2小时后,加入proteinA琼脂糖珠子,低温孵育过夜。为检测酸性条件下两蛋白的结合,细胞裂解之前,使用1M的HC1调节设定pH值。SDS-PAGE分离蛋白,转膜至PVDF膜,分别使用HA和Flag抗体孵育,相应的二抗孵育后,加入增强发光试剂ECL,显色,观察。免疫荧光检测GDNF,SorLA两分子在细胞中的共定位从发育18天的大鼠胚胎脑中取海马皮层神经元,体外培养7天。脂质体共转GDNFHA和FlagSorLA到神经元中,24小时后,4%多聚甲醛固定神经元,使用0.4%的Triton X-100透化40分钟,然后加入10%山羊血清封闭。分别使用HA和Flag抗体孵育1小时,加入不同荧光二抗避光孵育1小时,封片,使用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。GDNF分泌的检测PC12细胞中同时存在组成型分泌途径和调节型分泌途径,因此,本研究使用PC12细胞检测GDNF的分泌。在此细胞中电转GDNFHA及相应的干预蛋白,48小时后,弃细胞培养液,加入Krebs’-Ringer’s-Henseleit (KRH) buffer (125NaCl,4.8KCl,2.6CaCl2,25HEPES,1.2MgSO4,5.6Glucose,1Sodium ascorbate,和1.2KH2PO4,以mM为单位)孵育2小时,收集液体,用于检测蛋白组成型分泌。紧接着加高钾离子KRH buffer (56mM KCl和75mM NaCl),孵育10分钟。收集液体,用于检测蛋白调节型分泌。裂解细胞,western blot检测细胞裂解液、组成型分泌液和调节型分泌液中GDNF的表达。实验结果GDNF和SorLA之间存在相互作用PC12细胞中共转GDNFHA和FlagSorLA,收集裂解液,分别加入ployHA, proteinA琼脂糖珠子和M2珠子免疫沉淀,同对照组相比,在其免疫沉淀物中通过western blot检测到另外一种蛋白。从而证实两蛋白存在于一个复合体中。为了排除由于过表达导致的结合,我们裂解大鼠脑,检测两蛋白的内源性结合情况,结果表明,在大鼠脑中,GDNF和SorLA存在内源性结合。为了进一步证实这个结果,我们在培养7天的海马皮层神经元中,共转GDNFHA和FlagSorLA,使用免疫荧光的方法检测两蛋白在细胞中的共定位。结果显示,两者存在较好的共定位。SorLA促进GDNF的调节型分泌大部分SorLA聚集在反式高尔基网(trans-Golgi network, TGN),少量在膜表面表达。为了检测SorLA发挥作用的部位,我分别观察了膜表面和胞内的SorLA对GDNF的影响。膜表面的免疫共沉淀显示,两者在此位置没有相互作用而且SorLA过表达对GDNF-RET信号通路的激活没有显著影响。从而排除了SorLA在膜表面影响GDNF信号通路的可能。那么,SorLA是否在胞内调节GDNF的运输呢?我们发现,在SorLA过表达的情况下,GDNF的调节型分泌显著增强而组成型分泌没有可见变化。为了进一步证实这个结果,我们构建了SorLA的小干扰RNA,小干扰RNA抑制内源性SorLA的表达后,GDNF在组成型分泌没有明显变化情况下其调节型分泌显著降低。另外,我们通过免疫共沉淀反应证实SorLA同GDNF结合区域为SorLA vps10p。过表达只包含vpsl0p截短型SorLA突变体,作为dominant negative影响正常SorLA的功能,结果显示GDNF调节型分泌明显受到抑制。SorLA对GDNF分泌的调控是通过作用于GDNF pro-domain实现的众多报道显示,各类神经营养因子pro-domain在他们的很多功能发挥中起到关键的调控作用。为了检测GDNF pro-domain是否具有类似的功能,我们构建了只包含pro-domain和只包含mature domain的GDNF突变体,免疫共沉淀,观测同SorLA-vps10p的结合。实验结果表明,在中性pH条件下,发现两个突变体同SorLA-vps10p均存在结合。然而,在TGN腔内pH(6.4)值环境下进行同样实验,我们发现只有pro-domain结合,当pH值5.5(调节型分泌小泡内pH值)时进行实验,同样看到只有pro-domain结合。从而,证实SorLA对GDNF分泌的调控是由存在于TGN的SorLA同GDNF pro-domain结合,然后携带GDNF进入调节型分泌途径。为了进一步证实这个实验结果,我们检测了SorLA过表达对GDNF pro-domain和mature domain两个突变体分泌的影响。结果显示,SorLA的存在使得GDNF pro-domain的调节型分泌明显增加,对mature domain分泌则没有任何影响。SorLA对GDNF分泌调控的特异性我们检测了SorLA对GDNFA78分泌的影响,发现同对照组相比,过表达SorLA后,GDNFA78组成型分泌和调节型分泌均没有明显变化。另外,我们还观察了vps10p受体家族的另一成员sortilin对GDNF分泌的影响。结果表明,sortilin同GDNF存在结合,然而,酸性pH下这种结合则消失了。并且过表达sortilin对GDNF分泌没有明显影响。从而表明SorLA对GDNF作用的特异性,也说明pro-domain在此调控中发挥的关键作用。实验结论1) SorLA跟GDNF之间存在相互作用,两分子在胞内存在于同一个复合体中,SorLA共存于包含GDNF的小泡中。2) SorLA特异性促进GDNF调节型分泌,而组成型分泌不受明显影响。3) GDNF pro-domain在SorLA对GDNF分泌的调控中发挥关键作用,证实了pro-domain在各类神经营养因子功能发挥中的重要性。创新点4)我们的研究第一次发现并进一步探讨SorLA刘GDNF分泌的调控。5)我们鉴定出GDNF pro-domain是同SorLA结合的关键区域。6)我们的结果进一步提示pro-domain对神经营养因子功能调控的重要性。