研究背景:肺癌(Lung Cancer)作为最常见的恶性肿瘤之一,严重危害我们全世界人们的身心健康,给病人及其家庭带来不可磨灭的灾难。随着科学技术的不断发展,以及医学的不断进步,人类的很多疾病逐渐被攻克。但是,肿瘤一直是难以解决的问题。大多数人的健康意识比较薄弱,往往出现病症时,已经是癌症晚期,延误了治疗的最佳时机,治疗效果欠佳。在我国,肺癌发病率己位居所有肿瘤的第一位,是头号的健康杀手。目前,肺癌主要有四种基本治疗方法:手术治疗、放疗、化疗及靶向治疗。尽管手术治疗和放疗技术都取得一定进步,但是肺癌的预后情况仍很差,中国肺癌五年生存率仅为16.1%。肺癌主要包括两种类型,分别是小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)。小细胞肺癌在肺癌中占的比例大约为20%,小细胞肺癌倍增时间短、增殖比率高、广泛转移发生早,大多数小细胞肺癌患者有血行转移。手术只适合很少的手术可切除的I期小细胞肺癌的患者,约2%-5%。就是说目前诊断为1期的小细胞肺癌不超过整体小细胞肺癌患者的5%,超出T1-2N0的患者不能从手术中获益。在局限期患者中,依托泊苷加顺铂的化疗方案联合胸部放疗后预计有效率为70%-90%,而在广泛期患者中,单纯联合化疗预计有效率为60%-70%。虽然小细胞肺癌对初始化疗和放疗高度敏感,然而其恶性程度非常高,大多数患者最终死于复发。局限期患者的中位生存期为14-20个月,广泛期患者的中位生存期为9-11个月。在接受合理治疗后,局限期患者的两年生存率约为40%,广泛期患者两年生存率不超过5%。发病率高,合理治疗后生存率低,这就是现阶段小细胞肺癌的防治现状。因此对小细胞肺癌的治疗和研究一直是国内外科研工作者们的重点。STK33(serine/threonine kinase33,STK33)是丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase,STK)超家族的成员,主要作用为磷酸化蛋白质中丝/苏氨酸,在细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤转移等方面发挥了关键作用。STK33基因位于染色体11,llp15.3区域,并且包括12个内含子和1545 bp开放阅读框。STK33开放阅读框最多可达1545 bp,编码57.8 kDa的推定蛋白。STK33经常在不同种类的肿瘤中高度表达,尤其是在肺腺癌和大细胞肺癌中。核糖体S6激酶1(ribosome protein subunit 6 kinase 1,S6KI)是雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamycin,mTOR)的一个下游分子,S6K1激活后,可以磷酸化S6的核糖体蛋白(RPS6),从而进一步地促进细胞的增殖分化以及相关蛋白的合成。BAD是Bcl-2家族中的一员,众所周知Bcl-2家族成员主要包括三种成员,一种是可以抑制细胞凋亡的Bcl-2、BHRFl、Bcl-X1和Ced-9,一种就是增强细胞凋亡的Bad、Bax、Bak、Bcl-Xs,最后一种就是参与调解细胞存活的基因。因此上述三种蛋白都可以调控细胞的增殖侵袭和凋亡,预示S6K1/RPS6/BAD信号通路可能是STK33基因调控小细胞肺癌发生的机制,但需要进一步深入探讨。研究目的:本研究探讨STK33能否通过调控S6K1/RPS6/BAD信号通路,进而影响小细胞肺癌的增殖、侵袭及凋亡。并进一步阐明STK33通过调控S6K1/RPS6/BAD信号通路抑制小细胞肺癌发生的机制。为更好的进行小细胞肺癌临床检测以及临床治疗提供更多的理论依据,为医务工作者更好地对肺癌患者进行针对性治疗提供更多的证据。研究方法:本课题通过选取pGCsi-HI与shRNA载体构建STK33干扰质粒,转染进人经典小细胞肺癌细胞系NCI-H446、DMS153中的方法,利用聚合酶链锁反应Real-time Polymerase Chain Reaction(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(western blot,WB)技术检测不同shRNA的干扰效率。通过MTT测试方法检测小细胞肺癌的细胞活性,并进一步通过流式细胞仪分析小细胞肺癌细胞的细胞周期及凋亡,从而对小细胞肺癌细胞的增殖和凋亡情况进一步分析。通过Transwell侵袭和迁移实验、细胞划痕实验明确STK33对体外小细胞肺癌细胞的转移能力的影响。使用正常NCI-H446细胞、稳转pRNA-Hl.1质粒的NCI-H446细胞、稳转pRNA-H1.1-shSTK33质粒的NCI-H446细胞分别构建裸鼠移植瘤模型,观察裸鼠移植瘤的生长情况,进一步反映STK33对体内小细胞肺癌细胞肿瘤生成能力的影响。取出移植瘤组织,通过免疫组化技术(immunohistochemical analysis,IHC)分析STK33对组织中p-S6K1、p-BAD蛋白表达的影响。采用RT-qPCR技术检测敲低STK33后,RPS6,S6K1,caspase 9,BAD的表达变化。WB技术进一步明确STK33对RPS6,p-RPS6,S6K1,p-S6K1,cleaved caspase 9,BAD,p-BAD表达的影响,进一步明确其作用。研究结果:1.敲低STK33抑制了小细胞肺癌细胞的增殖能力我们通过MTT实验结果发现,敲低STK33后,小细胞肺癌细胞增殖活性受到抑制,此实验效果可在时间序列实验中评估。将不同类型的细胞共同孵育120小时,每隔24小时,用MTT 比色法测定记录每个组中的OD490值。shSTK33组吸光度值均低于对照组和NC组各时间点,并且shSTK33组与其他两组之间差异均有统计学意义(P<0.05),表明降低STK33的表达减慢了小细胞肺癌细胞的增殖速率,STK33在小细胞肺癌细胞增殖方面发挥了关键作用。2.敲低STK33诱导小细胞肺癌细胞凋亡和阻滞G1细胞周期。我们通过流式细胞仪结果发现,敲低STK33可诱导小细胞肺癌细胞的凋亡。对照组中细胞的平均凋亡率分别为:(NCI-H446细胞3.7±0.5%,DMS153细胞2.8±0.3%).NC组细胞的平均凋亡率分别为:(NCI-H446细胞4.2±0.6%,DMS153细胞3.7±0.6%).shSTK33组细胞的平均凋亡率分别为:(NCI-H446细胞12.7±0.6%,DMS153细胞15.6±1.1%).统计学结果发现,shSTK33组与其他两组之间差异均有显著的统计学意义(P<0.05)).进一步说,敲低STK33也将小细胞肺癌细胞NCI-H446阻滞在G1细胞周期。在shSTK33组中,细胞分布在G1期的平均比例比对照组和NC组高,shSTK33组与其他两组之间差异均有显著的统计学意义(P<0.05))。综合上述MTT法检测的结果,表明STK33在小细胞肺癌细胞的生存和存活率方面发挥了重要作用,抑制STK33可显著抑制肿瘤的发生和发展,从而对肿瘤发生作用。3.敲低STK33抑制小细胞肺癌细胞的侵袭能力恶性肿瘤的转移关键取决于肿瘤细胞的侵袭能力。因此,我们用Transwell侵袭实验和划痕实验来评估敲低STK33在小细胞肺癌细胞侵袭特性方面的作用。Transwell侵袭实验结果发现与对照组和NC组相比,小细胞肺癌细胞组在敲低STK33后,穿过聚碳酸酯膜的细胞数减少。为了进一步了解STK33对小细胞肺癌细胞迁移能力的抑制效应,我们通过细胞划痕实验结果发现,STK33 shRNA细胞比没有转染此基因的细胞伤口闭合要延迟,划痕的距离要更大。综上所述,STK33不但影响小细胞肺癌细胞的生存和增殖而且在肿瘤的侵袭潜力方面起决定性作用,STK33敲低可以显著抑制小细胞肺癌细胞的侵袭和迁移能力。4.敲低STK33在小细胞肺癌中通过抑制RPS6/BAD信号通路发挥了作用为了进一步验证RPS6/BAD信号通路在STK33调控小细胞肺癌细胞中的作用,我们通过Western以及PCR技术检测S6K1/RPS6/BAD信号通路的表达情况。该途径己被证明与非小细胞肺癌里STK33的功能相关。然而,在现在的研究里,敲低STK33对S6K1活动没有影响。有关这一通路其他指标的表达状况与以前的报告是相同的。结果发现敲低STK33减少了RPS6的磷酸化,S6KI的下游效应器需要核糖体生物发生和蛋白质合成.敲低STK33也抑制了p-BAD的表达,然而对总BAD没有影响。此外,敲低STK33诱导裂解半胱氨酸蛋白酶9的表达,这表明被抑制的STK33诱导的细胞凋亡是通过线粒体途径介导的。为了进一步验证STK33低表达与S6Kl1/RPS6/BAD信号通路的关系,我们用STK33的抑制剂ML281抑制其活性。MTT实验结果发现ML281抑制剂组细胞生存能力均低于对照组和Mock组,ML28I抑制剂组与其他两组之间均有统计学意义,表明NCI-H446细胞的细胞活力受到STK33抑制剂ML281的抑制。qRT-PCR和Western Blot检测结果显示,ML281抑制剂组p-RPS6、p-BAD蛋白表达明显受到抑制,而总RPS6和总BAD蛋白表达无变化,且ML281抑制剂组中裂解半胱氨酸蛋白酶-9的表达明显升高,综上所述结果表明,敲低STK33可抑制小细胞肺癌中RPS6/BAD信号通路的表达,但不是特定的通过S6K1通路,并且该途径是通过线粒体途径介导的。5.在小细胞肺癌异种移植大鼠模型中,敲低STK33可通过抑制RPS6/BAD信号抑制小细胞肺癌的生长体外实验结果进一步在动物模型中被测试。我们将小细胞肺癌细胞株NCI-H446的三种类型(Control、NC和shSTK33组)通过皮下接种到BALB/c裸鼠腹股沟下,来构建裸鼠移植瘤模型。每隔三天,利用游标卡尺来测量接种到裸鼠腹股沟下的移植瘤的体积,观察其生长情况,一直持续到第22天,我们通过结果发现在第16天,shSTK33组裸鼠移植瘤体积明显低于对照组或NC组(P<0.05)。取出移植瘤组织,提取组织蛋白,WB结果发现,shSTK33组的p RPS6和p-BAD的表达水平都显著低于对照组或NC组(P<0.05),并且shSTK33组中的裂解半胱氨酸蛋白酶9的表达明显高于对照组和NC组,而总RPS6和总BAD蛋白无太大变化,这结果与体外实验的结果是一致的。综上所述,结果表明STK33基因在小细胞肺癌的发展中发挥了关键性作用。结论:1.SCLC细胞中敲低STK33可显著抑制细胞增殖和侵袭,同时诱导细胞凋亡。2.与表型特征的变化相关联,敲低STK33也减少了 RPS6的磷酸化和BAD(细胞凋亡相关蛋白)而增加表达的裂解半胱氨酸蛋白酶9,表明细胞凋亡诱导STK33抑制通过线粒体途径介导。3.同样发现,STK33抑制剂也可显著抑制小细胞肺癌细胞的细胞活性,并且可显著抑制RPS6/BAD途径。4.此外,STK33敲低也能抑制移植瘤的生长和RPS6f/BAD的表达。表明STK33在SCLC细胞中的低表达通过线粒体途径诱导细胞凋亡,推测STK33可能有特定的癌症特性。意义:首次阐明STK33通过调控S6K1/RPS6/BAD信号通路,抑制小细胞肺癌发生的机制。为更好的进行临床检测以及临床治疗提供更多的理论依据,为医务工作者更好地对肺癌患者进行针对性治疗提供更多的证据。