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DNA拓扑异构酶是生物体内的基础酶类,参与到所有涉及DNA拓扑结构变化的生命活动中,如DNA的复制,转录,重组。DNA旋转酶是类型Ⅱ拓扑异构酶的一种,也是唯一能够引入负超螺旋的拓扑异构酶。结核分枝杆菌的旋转酶是该菌体内唯一的类型Ⅱ拓扑异构酶,是抗生素的重要作用靶标。
结核分枝杆菌旋转酶B亚基有四个主要的结构域:ATPase域、Transducer域、Toprim域和Tail域。本研究通过对结核分枝杆菌旋转酶B亚基的研究,构建了gyrB基因的缺失突变体gyrB463-714,gyrB1-631,gyrB1-482,gyrBi-270,gyrB271-480,gyrB485-714,gyrB278-714,gyrB1-542,gyrB1-519,gyrB1-500,将其连入表达载体pET28a,转入E.coliBL21中进行表达。表达并纯化野生型GyrB蛋白,缺失突变体GyrB1-462,GyrB463-714,GyrB1-631,GyrB1-482,GyrB1-270,GyrB271-480,GyrB485-714,GyrB278-714,GyrB1-542,GyrB1-519,GyrBi-500蛋白,将所得到的蛋白分别进行与单双链DNA结合的EMSA试验。试验结果发现,野生型GyrB蛋白能够结合单双链DNA;去除ATPase域后,GyrB278-714可以结合单双链DNA;去除ATPase和Transducer后的GyrB463-714可以结合单双链DNA;去除Toprim结构域和Tail结构域后的GyrB1-462,GyrB1-482可以结合单双链DNA;单独去除Tail结构域后的GyrB1-631可以结合单双链DNA;单独去除Toprim的GyrBΔtoprim能够结合单双链DNA。而单独克隆B亚基单个结构域的突变体亚蛋白不能得到表达,或表达后形成包涵体不能纯化。试验结果证实了结核分枝杆菌旋转酶B亚基是一个能够结合单双链DNA的蛋白;对旋转酶B亚基四个主要结构域分别进行缺失后,发现突变体蛋白保留了单双链DNA结合活性,表明这四个主要的结构域都具有不同程度的DNA结合活性,部分结构域的缺失对于DNA结合活性没有较大影响。