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丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是我国传统大宗药材之一，为唇形科鼠尾草属多年生草本植物丹参的根，主要用于心脑血管疾病的治疗，在我国和一些其他亚洲国家都有分布。丹参的有效成分分为水溶性的酚酸类成分和脂溶性的丹参酮类成分两大类，酚酸类成分包括丹参素、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B等，脂溶性成分包括丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮和二氢丹参酮I等。由于水溶性成分的特性更符合我国传统中药用水煎服的用药特点，近年来受到了越来越多的关注。本研究以丹参无菌苗和丹参毛状根为材料，对丹参酚酸类成分的生源合成调控机制进行了部分探讨，具体研究内容如下；1.利用同源克隆的方法从丹参中获得了4个R2R3MYB转录因子的核苷酸序列，分别命名为SmMYB39（GenBank accession No.：KC771280）、SmMYB29（GenBank accession No.：KC213792）、SmMYB87（GenBank accession No.：KC771280）和SmMYB36（GenBank accession No.：JX997333）。对其基因组DNA进行分析，发现SmMYB39包含2个外显子和1个内含子，SmMYB29不包含内含子，SmMYB87包含3个外显子和2个内含子，SmMYB36包含3个外显子和2个内含子。4条核苷酸序列分别包含了一个693bp、321bp、732bp和960bp的开放阅读框，分别编码230、106、243和319个氨基酸。在4条氨基酸序列的N端分别找到了2个MYB重复区，说明它们均为R2R3MYB蛋白。2.利用Genome Walking技术克隆得到了SmMYB36一段1137bp的启动子序列， PlantCARE分析表明，TATA-box位于转录起始位点上游30bp处，符合真核生物TATA-box的位置特点。该序列包含多个CAAT-box，散布于整条序列，另外还包含了多个光响应元件，如ACE、AE-box、AT1-motif、Box4、Box I、G-Box、GT1-motif、 I-box、MRE、as-2-box和chs-CMA2a等，说明光照对该基因的表达可能有重要的影响。3.利用实时定量RT-PCR技术检测了获得的4个R2R3MYB基因在开花期丹参根、茎、叶和花中的转录水平，结果表明4个目的基因在根、茎、叶和花4个器官中均有表达。SmMYB39在茎中的表达量最高，在花和叶中的表达次之，在根中的表达明显低于其它器官；SmMYB29也是在茎中的表达最高，在花中的表达次之，在根中的表达最低，其在叶中的表达虽然高于根，却明显低于在茎和花中的表达量；SmMYB87除在根中的表达稍低以外，在其他三个器官中的表达量差别不大；SmMYB36在根中的表达最低，在叶和花中的表达量几乎相同。4.构建绿色荧光蛋白融合表达载体，利用基因枪轰击洋葱表皮细胞，培养后在激光共聚焦显微镜下观察目的蛋白的亚细胞定位情况。结果在转化pTF-486空载体的洋葱表皮细胞中，绿色荧光蛋白散布于整个细胞中。在转化pTF-486-SmMYB39和pTF-486-SmMYB29的洋葱表皮细胞中，只在细胞核部位观察到了绿色荧光蛋白的分布。而在转化pTF-486-SmMYB87和pTF-486-SmMYB36的洋葱表皮细胞中，细胞核和细胞膜部位均观察到了绿色荧光。说明SmMYB39和SmMYB29定位于细胞核，而SmMYB87和SmMYB36除定位于细胞核外，还可能定位于细胞膜。5.构建获得的R2R3MYB基因的过表达和RNAi沉默表达载体，利用根癌农杆菌介导的植物转化体系获得过表达和RNAi沉默植株，研究目的基因在丹参酚酸类成分合成积累中的作用。结果发现SmMYB39的过表达显著（P<0.05）抑制了丹参中酚酸类成分的积累，而RNAi沉默则显著（P<0.05）提高了基因转化株系中酚酸类成分的含量，说明SmMYB39可以作为负调控因子参与丹参中迷迭香酸等酚酸类成分的生源合成。进一步的研究表明，SmMYB39可以作为转录抑制子调控迷迭香酸生源合成途径上C4H和TAT基因的转录，进而影响C4H和TAT的酶活性。6.克隆得到了3条丹参CHS基因保守片段，分别命名为SmCHS1（GenBankaccession No.： KF255832）、 SmCHS2（GenBankaccession No.： KF255833）和SmCHS3（GenBankaccession No.：KF255834）。构建CHS RNAi沉默表达载体，利用发根农杆菌ATCC15834获得转基因毛状根，并在获得的毛状根中添加水杨酸诱导子，研究CHS RNAi沉默和诱导子添加协同作用对丹参毛状根中酚酸类成分合成积累的影响。结果表明，CHS基因功能的缺失严重影响了丹参毛状根中黄酮类成分的合成积累，使代谢流向迷迭香酸生源合成途径上转移。水杨酸诱导子同样提高了丹参毛状根中酚酸类成分的含量，但CHS RNAi沉默和水杨酸诱导子协同作用更加高效地促进了丹参毛状根中酚酸类成分的合成积累，协同处理组中迷迭香酸和丹酚酸B的含量分别达到了未加任何处理的野生型毛状根中的3.89倍和4.26倍。7.利用酚酸类成分合成积累的“促进剂”茉莉酸甲酯和“抑制剂”真菌（Sclerotium rolfsii Sacc）菌丝提取物处理丹参毛状根，研究迷迭香酸生源途径两条平行支路上的关键酶对诱导子的不同响应。结果发现酪氨酸支路上的TAT和HPPR与酚酸类成分合成积累的变化呈现了更好的一致性。说明酪氨酸支路上两个关键酶与迷迭香酸及其衍生物的合成积累有更直接的关联，而苯丙氨酸支路上的关键酶可能由于参与多种苯丙烷类代谢物的合成过程，与迷迭香酸等酚酸类成分生源合成的关联不如酪氨酸支路上两个酶紧密。