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禽网状内皮组织增生症病毒是一种可引起感染鸡只产生免疫抑制和网状细胞瘤的RNA病毒,感染REV后的鸡只由于疫苗免疫后抗体反应受到显著抑制从而易于感染其它疾病,这给养鸡业可能带来不可估量的损失。近年来,REV感染率有明显上升的趋势,利用亚单位疫苗或DNA疫苗防制该病被认为是最具潜力的措施,但提高亚单位疫苗和DNA疫苗免疫保护反应也是亟待解决的科学技术问题,本课题利用CpG ODN/Poly(I:C)制备成新型核酸缓释佐剂,分别与REV亚单位疫苗抗原/DNA疫苗抗原联合免疫接种雏鸡,探讨了它们对两种疫苗免疫保护反应的调节作用。本研究首先从REV病毒感染细胞中扩增获得囊膜蛋白gp90基因,分别构建了重组原核表达载体pET-32a-gp90和DNA真核表达载体PVAX1-gp90。构建的pET-32a-gp90表达载体转化至Rosseta(DE3)菌体内,经IPTG诱导获得高表达的重组蛋白产物,利用SDS-PAGE和REV单抗介导的Western blot进行目的蛋白的鉴定分析,经镍柱纯化和蛋白定量后用作接种抗原。构建的DNA真核表达载体PVAX1-gp90用脂质体Lipo3000瞬时转染至鸡胚成纤维细胞(CEF)和哺乳动物细胞(BHK-21),用REV单抗介导的IFA分析其在细胞内表达,定量后用作DNA接种抗原。将CpG ODN与Poly(I:C)制备成核酸缓释佐剂,分别与上述制备的亚单位疫苗抗原和DNA疫苗抗原联合免疫雏鸡,加强免疫两次,使用美国IDEXX公司的REV抗体检测试剂盒动态监测雏鸡血清抗体,并结合攻毒试验分析对接种鸡只的免疫保护效果。此外,利用病毒中和试验分析诱导的抗血清对REV病毒特异性中和作用。结果表明,经PCR扩增得到大小为918 bp的目的基因,原核表达后获得大小为51Kd的重组蛋白,该蛋白能够与REV单抗发生特异性免疫反应;所构建的DNA真核重组表达载体PVAX1-gp90能够分别在BHK-21和CEF细胞中表达,以上结果显示抗原制备成功。用制备的核酸缓释佐剂分别联合接种雏鸡后显示(1)CpG佐剂与gp90重组蛋白接种雏鸡后可以诱导雏鸡产生显著增高的REV血清抗体,抗体阳性率可达到100%;而Poly(I:C)佐剂虽没有显著提高鸡只的血清抗体滴度和鸡只抗体阳性率,但两种核酸缓释佐剂却都能显著增强亚单位疫苗抗原的抗病毒作用,显著降低REV攻毒所造成的致病作用(包括病毒血症百分率和疫苗反应抑制)。(2)CpG缓释佐剂和CpG+Poly(I:C)缓释佐剂均能增强DNA真核质粒PVAX1-gp90的抗体滴度和抗体阳性率,均能够显著降低REV攻毒导致的病毒血症。(3)体外病毒中和试验结果表明,利用疫苗接种获得的不同滴度的血清抗体能够中和一定剂量的病毒,这种中和作用与血清抗体稀释度和病毒剂量高低呈相关性;IFA结果显示鸡血清抗体免疫球蛋白Ig能够直接结合CEF中的病毒粒子。结论:CpG-ODN缓释佐剂可以显著增强REV基因工程亚单位疫苗抗原的抗体反应,并对接种鸡只起到完全的保护作用。Poly(I:C)缓释佐剂虽不能显著增加REV亚单位疫苗的抗体反应,但可通过不同的机制对接种鸡只产生完全的保护作用。单一使用CpG-ODN缓释佐剂与联合使用CpG-ODN和Poly(I:C)缓释佐剂均能显著提高REV DNA疫苗抗原的免疫保护反应,但二者没有显著差异。