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一、研究背景和目的随着“人类基因组计划”的完成,揭开了人类遗传信息的秘密。许多遗传疾病和癌症都与基因序列中的突变密切相关,其中以单核苷酸多态性(single nucleotide polymerphisms, SNP)最为常见,大约每100-300个碱基就有一个碱基可能发生突变,因此实现单碱基突变的早期、准确、简便、快速的诊断,对于人类相关疾病的发病机理研究及早期治疗具有非常重要的意义。目前,对单碱基突变的检测方法报道很多。传统的方法普遍存在操作繁琐费时费力,影响因素较多,不能通用。尽管目前有了基因芯片、SNP检测仪等新的仪器设备和技术,但价格昂贵,仅适用大型科研机构。开发一些简便、价廉、准确且易于临床推广的方法是一件很有价值的工作。压电DNA生物传感器具有操作简便,响应迅速,灵敏度较高,价格低廉等特点,己经成为进行核酸的结构分析和单碱基突变检测的重要手段。漏声表面波(Leaky Surface Acoustic Wave, LSAW)传感器,是新发展起来的生物诊断技术,综合了物理、材料、微电子、信号处理、工艺等众多学科技术,利用压电晶体的特殊切向激励出LSAW,当LSAW传播路径表面的质量负载发生微小改变时,LSAW传播的频率和相位发生相应的改变,从而对与传感器表面生物敏感膜发生的生物学反应进行分析。与传统的体波传感器比较,LSAW传感器具有高灵敏度、高精度、重复性及可靠性更好、功耗低、结构工艺好等优点,这使LSAW传感器具有非常广泛的应用前景。在本室前期工作基础上,本研究使用谐振型LSAW传感器,结合DNA连接酶反应和酶生物信号放大系统建立了一种新的LSAW-SNP基因传感器检测方法,以乙型脑炎病毒E基因的一个SNP位点为靶点,初步研究LSAW-SNP基因传感器检测方法在实际样本检测中的应用情况。二、方法1.在前期研究的基础上,对双端谐振型传感器的结构、相位记录分析软件、温控系统进行改进,构建了更适合于液相检测的LSAW传感器系统。用NI虚拟仪器信号数据采集系统,实现了软、硬件系统的改进。设计了射频标签式传感器。2.探讨并优化了DNA-LSAW基因传感器检测系统进行液相检测时的各种影响因素,确定了杂交反应的时间。3.探讨酶生物信号放大系统用来放大LSAW基因传感器检测信号的可行性:分别用标记生物素和未标记生物素的探针固定于LSAW金膜的表面,然后加入标记了HRP的链酶亲和素进行反应,最后加入DAB/H2O2,检测相位的变化。4.利用酶生物信号放大系统,结合Taq DNA连接酶反应,建立LSAW-SNP基因传感器检测体系:分别合成两条寡核苷酸靶序列,两者之间仅存在一个碱基差异(A/G)。5′端巯基化修饰的DNA探针Probe-1通过自组装固定在金电极的表面,等位基因的可变碱基位于该探针3′末端,与target-G的可变形式对应。加入靶序列和与靶序列中SNP位点下游片段完全互补的生物素标记探针Probe-2,杂交后经热稳定Taq DNA连接酶连接DNA切口,然后经碱变性解杂交与靶序列完全互补的探针保留在传感器表面,再加入链霉亲和素连接的辣根过氧化物酶进行反应,最后加入DAB和H2O2,在金膜表面形成不溶性沉淀,导致LSAW基因传感器相位增大,从而检测到碱基变异位点的信息。5. LSAW-SNP基因传感器检测方法对实际样本的检测:以乙型脑炎病毒E基因的一个SNP位点(A2293G)为靶点,提取P3强毒株和SA14-14-2弱毒株的RNA,进行RT-PCR扩增,纯化ssDNA扩增产物,进行测序。用建立的LSAW-SNP基因传感器检测方法对1nmol/L ssDNA扩增产物进行检测。三、结果1.改进后的双端对谐振型LSAW传感器稳定性好,经网络分析仪和NI信号采集系统检测10分钟内气相和液相均≤0.1°,达到实验检测的要求。对同一浓度的探针和靶序列杂交,分别在网络分析仪和NI信号采集系统上进行实验,相位变化均为1.3°,达到了实验的要求。2.双端对谐振型LSAW传感器液相杂交反应的最适条件,最佳pH值为7.6,最佳离子浓度度为0.3mol/L,最佳DNA探针固定浓度为0.5μmol/L,最佳靶序列浓度为1.0μmol/L。并确定杂交反应最终时间为33min。3.经酶生物信号放大后,标记生物素的探针相位变化显著增大,相位增大了约16倍,而未标记生物素的探针相位变化很小。4. LSAW-SNP基因传感器检测结果,target-G能引起相位的显著变化,21倍于target-A。信号放大后的检测时间可缩至20min。对不同浓度的target-G进行检测,最低检出限为1×10-12mol/L。在1×10-12~1×10-6mol/L范围内target-G浓度的对数与传感器的相位变化值成良好的线性关系,线性回归方程为ΔP =1.853IgC+22.235,相关系数r = 0.976。5. SA14-14-2靶序列相位变化显著,P3靶序列相位变化很小,与基因测序结果一致。四、结论1.反射栅阵列的引入提高了有用信号的检测,改进后双端对谐振型LSAW传感器组成的检测系统可以满足实验检测和研究。2.酶生物信号放大系统可以显著增加LSAW基因传感器检测DNA靶序列时的相位变化,有效提高了信噪比,显著提高了检测的灵敏度,为生物传感器检测生物学反应提供了可靠的信号放大方法,在生物传感器领域有了极大的应用潜力。3.基于DNA连接酶和酶生物放大反应的LSAW-SNP基因传感器检测系统通过对乙型脑炎病毒实际样本SNP位点(A2293G)检测,具有较高的特异性、灵敏度和准确性。为临床SNP检测提供了一种快速、简便、经济实用的新方法。