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目的神经胶质瘤是一种最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,恶性脑肿瘤患者的术后化疗是目前治疗肿瘤的主要手段。由于正常脑组织存在血脑屏障(blood-brain barrier, BBB),而肿瘤组织也存在着血肿瘤屏障(blood-tumor barrier, BTB),从而限制了抗肿瘤药物进入肿瘤组织。因此有效地增加肿瘤组织中抗肿瘤药物的浓度,是提高化疗药物疗效的关键。我们前期研究发现缓激肽(bradykinin, BK)能够选择性开放BTB,也对相关机制进行了初探,发现BK开放BTB过程中出现PKA下调,细胞骨架重排,神经型一氧化氮合酶升高等,但BK的作用是通过何种信号通路发挥作用以及深入的分子机制如何,尚未见报道。RhoA/ROCK信号通路参与许多血管活性物质介导的内皮细胞通透性升高的过程。BK是通过与其2型受体(B2)作用开放BTB。B2受体属于G蛋白偶联性受体,BK、溶血磷脂酸和凝血酶是G蛋白偶联受体激动剂,可以使COS-7和成纤维细胞的G蛋白偶联性受体激活,进而通过RhoA信号通路介导丝状肌动蛋白(filamentous actin, F-actin)细胞骨架重排,引起紧密连接相关蛋白occludin、claudin-5和ZO-1重分布,紧密连接(tight junction, TJ)开放。另有研究证明RhoA/ROCK-MLC和RhoA/ROCK-LIMK-cofilin通路可以介导细胞骨架重排,开放BBB。上述信号转导通路是否参与BK开放BTB调节过程目前尚不清楚。本研究的目的是明确BK与B2受体结合后是否能够通过RhoA/ROCK通路调节紧密连接相关蛋白重分布,进而开放BTB,以及RhoA/ROCK-MLC和RhoA/ROCK-cofilin信号通路是否参与了BK选择性开放BTB的调节过程。方法1、大鼠体外BTB模型的制备。2、分别予以RhoA特异性抑制剂肉毒梭菌C3胞外酶(Clostridium botulinum C3 exoenzyme)和Rho激酶(Rho associated kinase, ROCK)特异性抑制剂Y-27632预处理体外BTB模型。3、应用Millicell-ERS电阻测量系统测量体外BTB的跨内皮细胞阻抗值(transendothelial electric resistance, TEER)。4、应用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)实验检测体外BTB的通透性。5、应用免疫荧光法检测BK作用后体外BTB模型上紧密连接相关蛋白occludin、claudin-5、ZO-1和细胞骨架蛋白F-actin的分布和表达水平的变化。6、应用western blot法检测BK作用前后体外BTB模型上紧密连接相关蛋白occludn、claudin-5和ZO-1的蛋白质表达水平；检测磷酸化的肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC).肌动蛋白素(cofilin)和总MLC、cofilin的表达。7、应用Pull-down方法检测RhoA活性。结果1、成功建立了大鼠体外BTB模型。2、BK作用后,体外BTB模型的TEER值显著降低,HRP流量显著增加。C3 exoenzyme或Y-27632预处理使TEER值显著升高,HRP流量显著降低。3、BK作用后,体外BTB模型上的内皮细胞紧密连接相关蛋白occludin、claudin-5和ZO-1由连续分布状态变为不连续分布状态,occludin和claudin-5由细胞膜向细胞质转移,ZO-1由内皮细胞的边缘向细胞质转移,occludin和claudin-5的可溶性片段(S)与不溶性片段(IS)IDV比值显著升高,ZO-1的蛋白表达显著降低；细胞骨架蛋白F-actin沿细胞边缘的分布减少,应力纤维增加,且分布在细胞中央区。C3 exoenzyme和Y-27632预处理后,occludin、claudin-5和ZO-1部分恢复连续分布状态,occludin和claudin-5由细胞膜向细胞质转移明显减少,ZO-1由内皮细胞的边缘向细胞质转移明显减少,occludin和claudin-5可溶性片段(S)与不溶性片段(IS)IDV比值显著降低；ZO-1的表达水平显著升高；F-actin沿细胞边缘的分布明显增多,细胞质中的分布减少,应力纤维明显减少。4、BK作用后,体外BTB模型上的内皮细胞的RhoA活性显著升高。BK作用5 min时开始增加,10 min时达峰值,之后降低。C3 exoenzyme预处理使RhoA活性显著下降。5、BK作用后,体外BTB模型上的内皮细胞的p-MLC和p-cofilin表达显著升高,BK作用5 min时开始增加,10 min时达峰值,之后降低。Y-27632预处理使p-MLC和p-cofilin表达显著下降。讨论我们的研究首次证明了在BK选择性增加BTB通透性的过程中,RhoA/ROCK信号通路对BK介导的细胞骨架重排,紧密连接相关蛋白occludin、claudin-5和ZO-1重分布和表达水平的变化起到了重要的调节作用。MLC和cofilin作为RhoA/ROCK通路的下游信号分子也参与了上述调节过程。HRP是一种示踪剂,通过透过BTB的HRP流量来检测体外BTB通透性的变化；跨内皮细胞阻抗实验也是一种检测体外BTB通透性的实验。我们的HRP流量实验和跨内皮细胞阻抗实验的结果显示,BK作用后TEER值显著降低,HRP流量显著增加,与Easton和Abbott报道的研究结果相一致。本研究进一步发现应用RhoA特异性抑制剂C3 exoenzyme和ROCK特异性抑制剂Y-27632预处理后,BTB的通透性显著升高,证明RhoA/ROCK信号通路参与调节BK介导的BTB通透性增加的过程。紧密连接是维持BBB完整性重要的结构基础。Occludin和claudin-5是构成紧密连接的主要跨膜蛋白,是维持紧密连接结构和功能重要组成部分。当occludin和claudin-5蛋白的可溶性片段(S)与不溶性片段(IS)IDV比值升高时,说明紧密连接结构变化,通透性增加。我们通过TritonX-100抽提技术和western blot技术同样证实了BK作用下occludin和claudin-5的可溶性片段(S)与不溶性片段(IS)IDV比值显著升高,说明BK作用下,紧密连接结构发生了变化,进而导致通透性增加。此结果与Nighot和Tenenbaum研究一致。本研究还发现C3 exoenzyme和Y-27632预处理后,显著抑制了occludin和claudin-5的可溶性片段(S)与不溶性片段(IS) IDV比值升高,提示RhoA/ROCK信号通路参与BK介导的TJ开放。胞质附着蛋白Zona occludens家族中的ZO-1同样是构成TJ的一个主要蛋白,ZO-1作为连接跨膜蛋白occludin和claudin-5和细胞骨架蛋白F-actin的桥梁蛋白,ZO-1的分布和表达的变化同样影响TJ的结构和功能。我们的研究发现BK作用后,ZO-1表达显著下降,C3 exoenzyme和Y-27632预处理后,显著上调ZO-1表达,说明RhoA/ROCK信号通路参与BK介导的TJ开放。为了进一步明确RhoA/ROCK信号通路与细胞骨架重排,紧密连接相关蛋白重分布,BTB通透性增高的关系,我们应用C3 exoenzyme和Y-27632预处理后,采用免疫荧光技术观察细胞骨架重排,紧密连接相关蛋白重分布的变化,明确RhoA/ROCK信号通路与细胞骨架重排,紧密连接相关蛋白重分布的关系。本研究发现BK作用后,occludin、claudin-5和ZO-1重分布,occludin、claudin-5由细胞膜向细胞质转移,ZO-1由细胞边缘向细胞质转移,同时F-actin由环状连续地分布于大鼠脑微血管内皮细胞(Rat brain microvascular endothelail cells, RBMECs)的边缘向细胞质中发生分布转移,同时伴有大量应力纤维形成。应力纤维收缩,牵拉ZO-1蛋白,使细胞膜上跨膜蛋白occludin和claudin-5重分布,紧密连接结构变化,使BTB通透性升高。C3 exoenzyme和Y-27632抑制了occludin、claudin-5和ZO-1的重分布、F-actin的重排和应力纤维的形成。说明RhoA／ROCK信号通路参与BK介导的细胞骨架重排,紧密连接相关蛋白重分布,BTB通透性增高的过程。一些研究证明RhoA活性升高可以使紧密连接通透性升高。我们的结果证实了BK介导BTB的开放过程中RhoA活性升高,说明了RhoA/ROCK信号通路参与BK介导BTB的开放,但是RhoA活性升高的峰值先于紧密连接开放, BTB通透性增加的峰值,其可能的原因是信号分子从上游传导到下游需要一定的时间,或者还有其它信号分子介导BK开放BTB。MLC和cofilin是ROCK重要的下游信号分子,ROCK通过直接磷酸化MLC或通过磷酸化肌球蛋白磷酸酶的肌球蛋白结合亚单位起作用,调节MLC的磷酸化,在调控细胞的动态改变中起着重要作用。ROCK还可以激活LIM激酶(LIM Kinase, LIMK), LIMK磷酸化cofilin, cofilin是肌动蛋白丝解聚所必需的,磷酸化后肌动蛋白脱聚合化活性受抑制,增加了应力纤维的稳定性。磷酸化的MLC和cofilin是介导细胞骨架重排的重要信号分子。我们的研究发现BK作用后,(?)-MLC与MLCIDV比值及p-cofilin与cofilin IDV比值呈时间依赖式显著升高,BK作用10 min时达峰值,以后逐渐下降。这个峰值先于细胞骨架重排,紧密连接开放,BTB通透性增加的峰值,而与RhoA活性的峰值一致,说明MLC和cofilin是F-actin、ZO-1、occludin和claduin-5上游信号分子。Y-27632预处理后,抑制p-MLC和p-cofilin表达,说明ROCK-MLC和ROCK-cofilin参与BK介导BTB开放。Chen SH证实新型隐球菌通过ROCK-LIMK-cofilin通路穿过BBB,导致脑膜脑炎；Li B同样证实小细胞肺癌细胞通过RhoA/ROCK-MLC和RhoA/ROCK-cofilin通路迁移穿过BBB,导致小细胞肺癌脑转移。上述结果证明,RhoA/ROCK-MLC和RhoA/ROCK-cofilin信号通路对BK介导的细胞骨架重排,紧密连接相关蛋白occludin、claudin-5和ZO-1重分布和表达水平的变化起到了重要的调节作用。结论1、RhoA/ROCK信号途径参与BK选择性开放BTB的调节过程。2、MLC参与BK选择性开放BTB的调节过程,且为RhoA/ROCK下游信号因子。3、Cofilin参与BK选择性开放BTB的调节过程,且为RhoA/ROCK下游信号因子。