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背景和目的糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症之一,也是终末期肾病的主要原因。糖尿病肾脏病变主要表现为肾小球血管异常新生、足细胞损伤、系膜基质增生、基底膜增厚以及炎症细胞浸润等。其中糖尿病内皮细胞功能异常是目前研究的热点,内皮细胞损伤介导的血管异常新生、炎症细胞黏附是糖尿病心血管和肾脏疾病的常见原因。前列腺素E2（Prostaglandin E2,PGE2）主要在肾脏合成,是花生四烯酸经环氧化酶（Cyclooxygenase,COX）等代谢产生的,通过作用于4个受体亚型EP1、EP2、EP3和EP4发挥作用。其中,EP4主要表达于内皮细胞和炎症细胞,参与血压调节、肿瘤等多种疾病。另外,COX2-PGE2-EP4已被多项研究证实参与多种慢性肾脏疾病过程,但具体作用目前仍有争议,其原因可能是不同细胞EP4作用差异引起的。为探讨EP4在糖尿病肾病中的作用,我们构建了内皮细胞特异的EP4缺陷小鼠,通过多种实验技术手段阐明内皮细胞EP4在糖尿病肾病中的具体作用,为糖尿病肾病的临床治疗提供新的思路和方向。方法（1）构建内皮细胞特异的EP4缺陷小鼠（EP4 Tie2-Cre）,同笼生无Cre重组基因的小鼠（EP4flox/flox）作为对照;对这些小鼠腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导1型糖尿病小鼠模型;（2）STZ处理EP4Tie2-Cre和EP4flox/flox糖尿病小鼠后,观察小鼠一般状态,监测小鼠体重、血糖、尿量、血压、心脏功能以及尿蛋白;12周后处死小鼠,收集血清检测肌酐、尿素氮等肾脏功能指标。（3）EP4 Tie2-Cre和EP4flox/flox正常和糖尿病小鼠肾脏组织PAS染色和透射电镜扫描检测其大体和显微结构的变化,CD31免疫荧光鉴定肾小球血管新生变化,F4/80免疫组化检测肾脏巨噬细胞浸润,western blot定量其炎症细胞黏附相关蛋白 ICAM 1（Intercellular cell adhesion molecule-1）及纤维化指标α-SMA（Alpha smooth muscle actin,α-SMA）、和 I型胶原（Collagen I）变化;（4）分离培养EP4缺陷（EP4-KO）和野生型（EP4-WT）小鼠肾小球内皮细胞,荧光鉴定其纯度,CCK8及小管形成实验检测EP4表达在正常和高糖条件下对血管新生能力的影响;（5）分离野生小鼠肾小球内皮细胞,EP4激动剂及PKA和epac的抑制剂H89和ESI-09处理,应用CCK8及小管形成检测EP4及其下游抑制剂对内皮细胞血管新生能力的影响;（6）体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,siRNA干扰CREB1的表达,同时给予EP4激动剂处理,qPCR检测EGR1的mRNA;UCSC查找EGR1的启动子区,应用Jaspar网站在线预测EGR1的启动子区是否存在CREB1的结合位点;（7）EP4-KO和EP4-WT肾小球内皮细胞加入荧光标记的THP1细胞,检测其对THP1的黏附能力,另外western blot检测细胞黏附因子ICAM1的表达;（8）EP4激动剂,及其下游PKA和epac的抑制剂H89和ESI-09处理HUVEC后,加入荧光标记的THP1,检测其对THP1的黏附能力,western blot检测内皮细胞调节黏附关键蛋白ICAM1表达;同样的,siRNA干扰内皮epac1的表达,检测细胞ICAM1表达和THP1黏附。验证EP4调控内皮细胞黏附的通路和靶蛋白。结果（1）成功构建内皮细胞特异的EP4缺陷小鼠（EP4 Tie2-Cre）,同笼生EP4flox/flox作为对照。并且内皮细胞特异性蛋白endomucin与EP4荧光双染结果显示,EP4 Tie2-Cre小鼠肾小球内皮细胞EP4表达显著下调;（2）内皮细胞EP4缺陷糖尿病小鼠（EP4 Tie2-Cre-STZ）和野生型糖尿病小鼠（EP4flox/flox-STZ）均出现血糖升高,体重下降,尿量增加等典型糖尿病症状。提示糖尿病模型构建成功。部分野生型糖尿病小鼠（EP4flox/flox-STZ）出现死亡,而EP4 Tie2-Cre-STZ小鼠未出现死亡情况,并且两组小鼠血压和心功能无显著差异。但是,EP4 Tie2-Cre-STZ小鼠血肌酐、尿素氮及肾脏体重比等肾损伤指标低于EP4flox/flox-STZ小鼠;提示EP4Tie2-Cre-STZ小鼠生存率的提高可能与其改善糖尿病肾脏并发症有关。（3）STZ诱导12周后,EP4flox/flox-STZ小鼠肾脏PAS染色结果显示肾小球体积增大、细胞外基质增生,电镜结果显示小鼠足突融合、基底膜增厚,等肾小球结构损伤表现,而EP4T e2i-Cre-STZ小鼠以上症状显著减轻;提示内皮细胞EP4缺陷糖尿病小鼠肾小球结构损伤明显改善。另外,与EP4flow/flox小鼠,EP4flox/flox-STZ小鼠肾脏CD31免疫荧光显示肾小球血管密度增加,F4/80免疫组化显示巨噬细胞浸润;并且炎症细胞黏附蛋白ICAM1表达增加,而以上肾脏病理学变化在EP4 Tie2-Cre-STZ小鼠显著减轻,提示内皮细胞EP4缺陷改善糖尿病肾小球异常血管新生和炎症细胞浸润,且炎症细胞浸润的改善可能与ICAM1的表达降低有关。（4）EP4flox/flox-STZ小鼠肾脏纤维化相关蛋白α-SMA和collagenI的表达上调显著低于EP4flox/flox-STZ小鼠,证实内皮细胞EP4缺陷可能改善糖尿病肾脏纤维化。（5）EP4缺陷的原代肾小球内皮细胞（EP4-KO）在高糖状态下的细胞增殖和成管能力均低于野生型小鼠（EP4-WT）;另外,EP4激活促进内皮细胞增殖和小管形成可以被cAMP下游PKA拮抗剂H89抑制,干扰PKA下游CREB1的表达可以抑制EP4激活诱导的EGR1转录增加;并且EGR1启动子区存在CREB1的疑似结合位点。提示EP4通过cAMP-PKA-CREB1调控EGR1的转录和翻译影响糖尿病患者肾小球异常血管新生。（6）EP4缺陷抑制高糖诱导的内皮细胞对THP1的黏附和ICAM1的表达,激活内皮细胞EP4促进THP1的黏附和炎症细胞黏附因子ICAM1的表达增加,然而以上过程可以被cAMP下游epac1的拮抗剂ESI-09和epac1的siRNA所抑制。提示内皮细胞EP4可以通过cAMP-epac1调控ICAM1的表达影响糖尿病患者肾小球巨噬细胞浸润。结论内皮细胞EP4缺陷通过抑制肾小球微血管异常新生和减少炎症细胞黏附共同作用改善糖尿病肾脏并发症。