黄瓜绿斑驳花叶病毒、番茄环斑病毒及南方菜豆花叶病毒的分子检测技术研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lzj668
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以辽宁盖州地区表现黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV-LN)症状的西瓜叶片为材料,以总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得了CGMMV-LN的四段部分重叠并覆盖全长的片段。序列分析结果表明:CGMMV-LN全长基因由6422个碱基组成,cp基因由486个碱基组成,编码161个氨基酸,与已报道的其他11个CGMMV分离物相同。核苷酸序列同源性在90%以上,氨基酸序列同源性高于98%。CGMMV-LN的3NTR由176个碱基组成,与CGMMV-KW、CGMMV-SH和CGMMV-KOM的碱基数目相同,但比CGMMV-W多1个碱基。与其他3种Tobamovirus属病毒3NTR末端的17个碱基则完全一致,3NTR序列的高度保守性有助于基因组末端RT-PCR引物的设计。 以引自加拿大的ToRSV悬钩子分离物(TORSV_Ra)接种番杏发病后为试材,以总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增病毒复制酶基因(RdRp)的cDNA片断并将其克隆到pMD18-T载体上。序列测定结果表明:Rasp-2 RdRp基因由2133个核苷酸组成,编码711个氨基酸;Rasp-2半胱氨酸蛋白酶和RdRp之间的蛋白酶切割位点为Q/v。Rasp-2与其他分离物及株系RdRp的核苷酸序列同源性为79%.84%,氨基酸序列同源性为89%-94%。聚类分析结果显示,葡萄黄脉株系(GYV)与其他分离物及株系关系最远,Rasp-2与其他分离物及株系亲缘关系较近。证实Rasp-2与另外2个悬钩子分离物Rasp和Rasp-1的核苷酸序列存在明显变异。 以来自甘肃感染CGMMV的南瓜果实为试材,以总RNA为模板,根据CP设计引物,进行RT-PCR扩增。结果表明:本试验所建立的RT-PCR检测方法可扩增出目标片段,将其CP序列与来自国内不同地区的其他CGMMV分离物进行序列比对,发现国内各分离物间的同源性为97%-99%,证明有很近的亲缘关系。 采用RT-PCR方法克隆了CGMMV-LN的CP基因并连接到原核表达载体pGEX-4T-3和pET-22b(+)上,将获得的重组子pGEX-4T-3-CGMMV CP和pET-22b(+)-CGMMV CP转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,融合蛋白分子量分别为43.8 kDa和17.3 kDa。将17.3 kDa融合蛋白纯化后免疫家兔,制备了CGMMV特异性抗血清,抗原包被间接ELISA法(ACP-ELISA)测定抗血清的效价为1/20,000。 分别将CGMMV-LN和SBMV-J(日本分离物)的CP基因连接至病毒载体p45p46上,得到了相应的重组载体pPVXCGMMV-CP和pPVXSBMV-CP。以线性化的空载体以及重组载体为模板进行体外转录,并将体外转录物接种至本生烟叶片。与空载体p45p46接种的植株对比,pPVXCGMMV-CP和HpPVXSBMV-CP均表现为加重的系统花叶症状。通过RT-PCR扩增检测到了CGMMV-CP和SBMV-CP基因。将CGMMV-LN的CP基因和3’NTR连接至载体pGEM-3Zf上,得到相应的重组载体pGEMCGMMV-CP-3’NTR。以线性化的重组载体为模板进行体外转录,并以体外转录的RNA和总RNA为模板,建立了CGMMV的实时荧光RT-PCR检测方法。总RNA的检测低限是0.13 Pg;体外转录RNA的检测低限是0.03 pg,相当于13764 copies/μL。 以南方菜豆花叶病毒日本分离物(SBMV-J)总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增病毒外壳蛋白基因及其上游基因的cDNA片断并将其克隆到pMD18-T载体上。序列分析结果表明:SBMV-J cp基因由801个核苷酸组成,编码266个氨基酸,SBMV-J与其他分离物及株系CP基因的核苷酸序列同源性为83%-97%,氨基酸序列同源性为86%-97%。根据SBMV各分离物及株系CP基因的保守序列设计引物和TaqMan-MGB探针,建立了SBMV的实时荧光RT-PCR检测方法。
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