植物激素调控马铃薯块茎发育及相关转录因子WRKY的功能研究

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马铃薯是世界上最重要的粮食作物之一,是发展中国家的重要主粮。其块茎的发育过程受多个信号的调控,比如环境因子、植物激素和遗传背景。在众多的植物激素中,ABA、GA等对块茎发育有重要影响,其中ABA促进块茎形成而GA抑制块茎形成,但其互作调控方式及分子机制均不清楚。研究马铃薯块茎形成机理对马铃薯产量和品质的提高均具有重要意义。基于高通量测序的RNA-Seq是功能基因挖掘的重要手段,基因挖掘后并阐明其作用机制,可为培育高产品种提供理论参考和技术支撑。本文系统测定了马铃薯品种PB06及会-2块茎发育的四个连续期匍匐茎/块茎及叶片中ABA、GA3、JA和IAA的动态变化。结果表明,随着块茎的发育,匍匐茎/块茎中ABA及JA含量增加,PB06中ABA积累及变化幅度均大于会-2;叶片中ABA含量逐渐增加,JA含量先上升后下降,两个品种变化趋势相同。GA3的积累随着匍匐茎的膨大而下降;IAA含量峰值出现在匍匐茎膨大时,并且在之后匍匐茎的膨大中仍然维持高含量水平。结果表明,IAA及GA3对匍匐茎的伸长是必要的,ABA、JA是诱导块茎形成的正调控因子,GA3为负调控因子。采用外源添加方式研究了ABA-GA对试管薯形成的作用。结果表明,GA3在低浓度(0.01μM)下即抑制试管薯的形成,当浓度达到0.5μM时不能形成试管薯;ABA可以有效促进低浓度蔗糖诱导下的结薯,并减缓GA3对试管薯诱导的抑制作用,但不能使0.5μM GA3处理结薯,说明GA是抑制结薯的主因,ABA的作用主要是解除GA对结薯的抑制。5μM ABA处理下不同浓度蔗糖诱导培养的试管薯淀粉含量均显著增加,暗示ABA可能促进淀粉合成相关基因的表达。为挖掘ABA诱导下块茎形成功能基因及逆境响应基因,本研究采用HiSeq平台对ABA处理及未处理的马铃薯匍匐茎进行RNA-Seq,结果表明261个基因发生差异表达,其中93个表达下调,168个表达上调。GO及KEGG注释结果表明,上调表达的的基因中有4个是块茎形成的标记基因,包括StPatatin、StGA2ox1、StSP6A及StBEL5,这些基因的表达上调验证了ABA促进块茎形成,但是ABA可能不是通过直接调控这些基因的表达促进结薯。GA、ABA、JA、ethylene代谢及信号途径基因的表达发生了显著变化,包括StGA2ox、CYP707A、PYL、PP2C、ABF、JAZ、ERF和EBF,对研究ABA与其它激素互作调控块茎形成具有重要的意义。几类重要的逆境相关基因包括WRKY、AP2/ERF、HSP、MYB、编码几丁质酶及过氧化物酶的基因表达发生变化,这些基因可能发挥抗逆作用,也可能正调控或负反馈ABA信号通路基因的表达。采用qRT-PCR验证了部分基因的表达,结果与RNA-Seq基因表达大致相同,表明测序结果可靠。通过筛选ABA诱导的差异表达WRKY基因,以期发现它们参与ABA信号途径调控块茎形成或在介导ABA与GA互作中的作用。克隆了所有差异表达WRKY基因并对其编码蛋白进行系统的生物信息学分析,并进一步通过原核表达WRKY57蛋白进行了验证。分别在拟南芥和马铃薯中过表达了StWRKY57,为进一步分析野生型及转基因株系植株中ABA及GA含量、块茎形成的区别和WRKY转录因子调控块茎形成的可能作用通路奠定了基础。对ABA、GA代谢及信号途径基因(StGA2ox1、StNECD2、StABF、StABI)启动子序列进行了分析,发现这些基因启动子上分布有W-box簇,为WRKY转录因子调控马铃薯ABA-GA平衡提供了生物信息学依据。
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