第一部分：PJ-34对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用基本背景：缺血性心脏病是严重威胁人类健康的常见疾病,再灌注治疗(包括药物溶栓、经皮冠状动脉腔内血管成形术+支架植入术和冠状动脉旁路移植术等)能有效恢复缺血心肌组织的血供和营养支持,是目前广泛开展的治疗心肌缺血和梗死的主要临床策略。但是,传统的再灌注治疗在恢复心肌供血的同时,,也带来了新的潜在威胁,即心肌的缺血再灌注损伤。心肌缺血再灌注损伤是缺血性心脏病再灌注治疗的主要伴发病理损伤过程,是指缺血心肌组织在恢复血液再供应后,不仅未能减轻原先缺血所带来的损伤,反而加重了其损伤程度甚至导致心肌细胞不可逆死亡的病理过程。临床上常表现为再灌注性心律失常及由于心肌顿抑所造成的心功能的持续性低下。随着再灌注治疗在缺血性心脏病治疗领域的普及,心肌缺血再灌注损伤的危害性和对预后的影响也日益凸显。如何在最大程度上减轻复灌心肌的再灌注损伤,已成为临床上广泛关注的热点。心肌缺血再灌注治疗的发病机制与诸多因素相关,其中最主要的是由于自由基的产生过多所引起的氧化应激损伤和细胞内的钙超载所造成的直接细胞损伤。目前研究已发现,包括缺血预处理、药物预处理、缺血后处理、药物后处理以及缺血旁处理等方法都对心肌的再灌注损伤有一定的保护作用。药物后处理由于其操作简便,实施时间易于掌握且作用靶点明确,在临床有有较高的使用价值。PARP-1 (Poly(ADP-ribose) Polymerase-1),即多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1,是存在于真核细胞细胞核内的主要其DNA损伤监测和修复作用蛋白酶,在心肌细胞中高表达。已有研究也表明,PARP-1在细胞的能量代谢和死亡诱导过程中发挥着非卷重要的作用,而其抑制剂具有潜在的细胞保护功能。实验目的：在本研究中,我们应用Langendorff离体心脏灌流系统构建大鼠全心缺血再灌注模型,并给予PARP-1的特异性抑制剂PJ-34后处理,来观察其对缺血再灌注损伤的心肌是否具有保护作用,并初步探讨其可能的作用机制。实验方法：利用Langendorff离体心脏灌流系统成功构建大鼠全心缺血再灌注损伤模型。实验用SD大鼠随机分为正常对照组(Control),缺血再灌注组(I/R)和缺血再灌注+PJ-34处理组(I/R+PJ-34)。对于各组离体大鼠心脏,给予氧饱和的K-H液灌流30min,使心脏活动达到相对平衡稳定后。Control组继续给予K-H液灌注150min直至实验结束；I/R组停灌K-H液30min后,继续给予K-H液再灌注2h；I/R+PJ-34组停灌30min后,继以混合有浓度为3mg/kg/h的PJ-34的K-H液复灌2h。分别用：(1)比色法测定各组离体心脏再灌注不同时间点(5min, 10min,20min,40min)漏出液中乳酸脱氢酶(LDH)含量；(2)MTT法测各组心肌组织活性；(3)TTC法测各组心肌梗死面积；(4)H&E染色法观察各组心肌组织病理形态学改变；(5) Medlab生物信号采集处理系统测定各组心脏再灌注期不同时间点(5min,10min,20min,40min,60min)的血流动力学指标(LVDP, LVEDP,+dp/dtmax,-dp/dtmax);(6)丙二醛(MDA)测定法间接评估心肌氧化应激损伤程度。实验结果：(1)PJ-34后处理显著减少了缺血心肌再灌注期各个时间点(5min, 10min,20min,40min)漏出液中的LDH含量；(2)PJ-34后处理显著改善了缺血再灌注损伤心肌细胞的活性；(3)PJ-34后处理显著减少了缺血再灌注损伤的心肌梗死面积；(4)PJ-34后处理减轻了因缺血再灌注损伤所造成的心肌组织病理形态学改变。后处理组的心肌细胞肿胀程度和炎症细胞浸润程度均较单纯缺血再灌注组为轻；(5)PJ-34后处理显著改善了缺血再灌注损伤所引起的心脏血流动力学异常：①改善了代表心肌收缩功能的指标LVDP和+dp/dtmax在再灌注期间的恢复情况(5min, 10min,20min,40min,60min);改善了代表心肌舒张功能的指标LVEDP和-dp/dtmax在再灌注期间的恢复情况(5min, 10min,20min,40min,60min)。(6)PJ-34后处理显著降低了缺血再灌注心肌中MDA的水平,从而间接反映后处理后心肌细胞氧化应激损伤程度的降低。实验结论：PJ-34后处理显著改善了心肌的缺血再灌注损伤,其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用可能是通过减轻心肌细胞氧化应激损伤而起效的。第二部分：PJ-34通过抑制AMPK激活而减轻细胞的氧化应激损伤：PARP-1和AMPK的交互作用研究背景：氧化应激损伤是心肌缺血再灌注损伤的主要致病机理之一,再灌注初期由于氧自由基的大量爆发产生,造成机体内氧化应激,进而导致线粒体功能受损及细胞内能量失衡,最终引起细胞死亡。这一过程涉及到细胞内很多复杂的信号通路和作用靶点。PARP-1和AMPK,作为细胞能量代谢和循环过程的两个重要蛋白,也在细胞氧化应急损伤过程中扮演了十分重要的角色。PARP-1是主要存在于真核细胞细胞核内的蛋白酶,其主要的功能时监测细胞DNA的损伤并参与细胞DNA的修复和转录等过程3。PARP-1激活后可以引起多聚核糖反应,并生成ADP核糖共价偶联于细胞内的众多受体蛋白,继而通过蛋白修饰改变受体蛋白的理化性质和功能,最终可以对细胞内的生理活动发挥作用。AMP激活的蛋白激酶(AMPK)是细胞内能量调节的关键蛋白酶,在心肌细胞内高表达。AMPK的主要功能时维持细胞内能量的稳态,并通过其磷酸化激活调节能量代谢的相对平衡。既往研究已经指出,AMPK不仅是细胞内能量的调控器,也参与了细胞内信号的传导和基因的表达,是细胞内生理活动的重要调控蛋白。作为细胞内能量代谢和生理活动的两个重要蛋白,PARP-1和AMPK之间的关系现在仍少人问津,而两者在缺血再灌注过程的作用和关联性,是一个值得探讨的课题。研究目的：我们以外源性H202刺激H9c2心肌细胞来构建心肌细胞的氧化应激损伤模型,以进一步明确PJ-34对于氧化应激损伤心肌细胞的保护作用,并深入探讨其可能的作用机制及其与AMPK之间的关联性。研究方法：本研究以一定浓度(1000μmol/L)的外源性H202短时间(1h)刺激H9c2细胞来构建心肌细胞的急性氧化应激损伤模型。PARP-1的抑制剂PJ-34, AMPK的抑制剂Compound C和AMPK的激活剂AICAR作为干预条件,分别按实验要求对目标细胞进行预处理(30min)。研究主要分三个部分：(1)研究PJ-34预处理对于H202诱导的心肌细胞损伤的保护作用；(2)研究PARP-1/AMPK通路在H202诱导的心肌细胞氧化应激损伤中的作用；(3)探讨细胞内PARP-1和AMPK两者之间的相互关系。在第一部分的研究中,我们分别检测各组细胞的活性指标及能量相关指标,以评估细胞的生存状态,同时通过蛋白免疫印迹实验检测相关蛋白的表达情况。在第二部分的研究中,我们分别对通路中不同层次蛋白进行激活或抑制的干预,进而观察对于信号传导和细胞生存的影响。在第三部分的研究中,我们通过蛋白转染技术将外源性活性蛋白直接转入细胞内,然后通过免疫共沉淀和蛋白免疫印迹技术观察细胞内目的蛋白间相互作用和联系。研究结果：(1)PJ-34预处理对于H2O2诱导的H9c2心肌细胞损伤具有显著的保护作用,具体包括：提高细胞活性,减少细胞死亡率,改善能量代谢和线粒体功能,抑制凋亡相关蛋白激活等；(2) PARP-1/AMPK通路的激活在H202诱导的H9c2心肌细胞氧化应激损伤中具有十分重要的作用,PARP-1和AMPK的抑制都可以减轻H202诱导的H9c2细胞的损伤,而AMPK的激活剂AICAR则可以部分逆转PJ-34的有益作用。(3)外源性的活性蛋白PARP-1被转染进入细胞后,细胞内PARP-1和/AMPK两种蛋白的表达和活性均增高,而免疫共沉淀实验也证明AMPK的激活与PARP-1的表达和活性直接正相关。研究结论：PJ-34预处理可以减轻H202诱导的H9c2细胞的损伤和死亡,其对于氧化应激损伤细胞的保护作用是通过抑制PARP-1活性进而抑制AMPK激活而介导的。细胞内PARP-1和AMPK两者之间存在着直接的正反馈调控作用。