第一部分去除C类神经纤维BALB/c小鼠多器官转录组学研究目的:1977年Jancsó等人首次报道了予出生2天的新生大鼠50mg/kg辣椒素皮下注射可以选择性不可逆地去除初级伤害感觉神经元。随后,他们通过电镜进一步观察到予新生大鼠辣椒素处理选择性去除的是无髓鞘的C类神经纤维（C fiber）,对有髓鞘的A类神经纤维（A fiber）无影响。在之后的半个世纪中,去除C fiber（C fiber degenerated,KCF）的动物模型为研究C fiber在不同疾病中的调控作用提供了可能。但KCF模型的建立和验证大多集中在大鼠模型,缺乏对KCF小鼠的全面认识。本研究拟全面探索KCF小鼠肺、肠、脑和脾四个重要器官的C fiber去除情况、基因表达谱以及可能的生物学功能变化。方法:予生后2天新生BALB/c小鼠50mg/kg辣椒素皮下注射,建立KCF小鼠模型。取6-8W的KCF小鼠及未处理的BALB/c小鼠（Intact小鼠）的肺、肠、脑和脾,蔗糖脱水后进行组织冰冻切片,通过免疫荧光标记CGRP（Calcitonin gene-related peptide,CGRP）观察KCF和Intact小鼠的各器官的C fiber表达变化。对KCF和Intact小鼠的肺、肠、脑和脾进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）,采用CIBERSORT算法分析不同器官免疫细胞浸润状态,探究KCF小鼠不同器官在转录水平以及在免疫细胞浸润水平的改变。通过DESeq2对KCF及Intact小鼠各器官分别进行差异分析寻找差异基因,并对各个器官差异基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。结果:免疫荧光标记C fiber发现KCF较Intact小鼠肺、肠、脑和脾的CGRP荧光强度显著降低,提示C fiber去除成功。基于RNA-Seq数据进行免疫浸润分析发现,与Intact小鼠相比,KCF小鼠肺、肠静息肥大细胞比例降低,脾脏单核细胞比例降低。分析RNA-Seq数据发现KCF较Intact小鼠4个器官在转录水平均有显著改变,以肠道为著。KCF小鼠各器官共同差异基因分析及基因表达谱聚类热图揭示KCF小鼠肺和肠的基因表达谱最为相似。差异基因的GO功能富集提示各器官的抗病毒通路均显著富集,KEGG通路富集分析发现4个器官的免疫、内分泌和代谢、病毒结合等相关通路发生改变。结论:生后两天辣椒素皮下注射可有效去除BALB/c小鼠C fiber。去除C fiber调控肺、肠和脾的免疫细胞浸润,在转录水平对小鼠肺、肠、脑、脾均产生显著影响,各器官的内分泌、代谢和免疫相关通路发生改变。值得注意是的,KCF小鼠各器官的抗病毒通路均发生显著变化,提示C fiber和宿主抗病毒反应密切相关。第二部分C类神经纤维调控RSV感染后宿主目的:第一部分研究显示C fiber影响肺、肠、脑和脾的抗病毒反应,课题组前期探索了C fiber在呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）感染早期抗病毒效应中的作用,发现:与Intact小鼠相比,RSV感染KCF小鼠肺组织匀浆RSV滴度显著下降,肺部炎症减轻,提示:C fiber参与调控RSV感染后宿主抗病毒效应。TRPV1（transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1）是C fiber上特异性表达的伤害感受性受体,文献报道RSV感染后感觉神经元上的TRPV1表达增加,抑制TRPV1可抑制基孔肯雅病病毒在巨噬细胞的复制,提示:病毒感染可影响TRPV1表达,TRPV1可调控病毒复制。这一部分我们将利用KCF以及抑制或激活TRPV1小鼠模型进一步探讨C fiber在调控RSV感染后宿主抗病毒效应中的作用。方法:予KCF小鼠和Intact小鼠RSV病毒液滴鼻,RSV感染后12h取小鼠肺组织进行RNA-Seq,通过DESeq2进行差异分析寻找差异基因,并进行GSEA通路富集分析,qPCR验证关键基因的表达。分别予Intact小鼠TRPV1抑制剂辣椒平（Capzepine,CPZ）和TRPV1激动剂辣椒素（Capsaicin,CAP）处理,并在处理后30min内予RSV病毒滴鼻,于感染后12h收集小鼠支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）,感染后3天收集小鼠肺组织,空斑、qPCR（Quantitative polymerase chain reaction,q-PCR）、组化染色观察小鼠肺组织RSV复制水平变化,HE（Himatoxylin and eosin staining,HE）染色观察小鼠肺部病理改变,ELISA检测IFN（Interferon,IFN）-α/β水平变化。结果:RNA-Seq结果提示KCF较Intact小鼠RSV感染后IFN-α/β产生的相关通路显著富集,qPCR进一步验证了KCF较Intact小鼠RSV感染后IFN-α/β表达水平显著增高。CPZ抑制Intact小鼠RSV感染后病毒复制,减轻肺部炎症,促进IFN-α/β产生;CAP处理促进Intact小鼠RSV感染后病毒复制,加重肺部炎症,抑制IFN-α/β产生。结论:抑制或去除C fiber可促进RSV感染后IFN-α/β产生,增强宿主的抗病毒效应;激活C fiber则抑制RSV感染后IFN-α/β产生,损害宿主的抗病毒效应。第三部分VIP在C类神经纤维调控RSV感染后宿主抗病毒效应中的作用及机制目的:上一部分我们通过RNA-Seq以及激活或抑制TRPV1进一步验证了C fiber调控RSV感染后的抗病毒效应。课题组前期研究结果发现:KCF小鼠BALF中血管活性肠肽（Vasoactive intestinal peptide,VIP）水平较Intact小鼠明显升高,VIP受体抑制剂促进KCF小鼠RSV感染后病毒复制,VIP抑制Intact小鼠RSV感染后病毒复制,提示:C fiber可通过VIP调控RSV感染后宿主抗病毒效应。本部分研究拟在前期研究基础上:（1）明确C fiber是否通过VIP调控RSV感染后抗病毒效应;（2）体内体外验证VIP可增强宿主RSV感染后抗病毒效应;（3）通过RNA-Seq结果进一步探索C fiber与BALF中VIP的调控关系。方法:VIP受体抑制剂（VIP inhibitor,VIPhyb）处理KCF小鼠,观察RSV感染后IFN-α/β、病毒复制以及肺部的病理变化。VIP处理Intact小鼠,观察RSV感染后IFN-α/β、病毒复制以及肺部病理变化。VIP体外处理肺泡巨噬细胞系MH-S,观察RSV感染后IFN-α/β变化,并探索PKA和PKC在VIP抗病毒效应中的作用。通过RNA-Seq结果分析Intact和KCF小鼠四个器官中VIP m RNA表达水平,ELISA检测Intact小鼠及KCF小鼠BALF和肠VIP的蛋白水平。予Intact和KCF小鼠RSV病毒液滴鼻,感染12h后取Intact及KCF小鼠肠组织进行RNA-Seq,通过DESeq2进行差异分析寻找差异表达基因,并对差异基因进行GO功能注释,并进一步通过RNA-Seq结果分析RSV感染后肠VIP与肺IFN-α/β表达水平的相关性。结果:VIPhyb抑制RSV感染KCF小鼠肺部IFN-α/β的产生,促进RSV复制,加重肺部炎症。VIP促进RSV感染Intact小鼠肺部IFN-α/β的产生,抑制RSV复制,减轻肺部炎症。VIP体外可促进MH-S的IFN-α/β表达,且此效应可被PKA（Protein kinase A,PKA）抑制剂而非PKC（Protein kinase C,PKC）抑制剂减弱。RNA-Seq结果表明Intact与KCF小鼠肠和脑高表达VIP,肺和脾则几乎不表达VIP,且KCF小鼠肠VIP表达水平显著高于Intact小鼠。进一步发现KCF小鼠较Intact小鼠肠道和BALF中VIP蛋白水平均升高。提示:KCF小鼠BALF中升高的VIP可能来源于肠。KCF小鼠RSV感染后肠RNA-Seq结果显示KCF小鼠肠多肽分泌、转运等相关通路显著富集,且RSV感染后肠VIP表达与肺IFN-α/β表达水平显著正相关。这些结果支持C fiber可能通过调控肠VIP表达进而影响BALF中VIP水平的猜想。结论:C fiber通过VIP调控RSV感染后的抗病毒效应;VIP通过PKA促进RSV感染后IFN-α/β表达,增强宿主抗病毒效应。第四部分肺泡巨噬细胞在VIP增强RSV感染宿主抗病毒效应中的作用及机制目的:C fiber通过VIP促进RSV感染后IFN-α/β产生,增强宿主抗病毒能力,但具体机制不明。研究表明肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophages,AMs）是RSV感染后产生IFN-α/β最主要的来源。去除AMs,显著降低RSV感染小鼠IFN-β的产生,促进RSV复制,气道给予小鼠肺泡样巨噬细胞处理,增高RSV感染小鼠IFN-β的产生,抑制RSV复制,提示:RSV感染后AMs数量变化决定IFN-α/β的产生,影响宿主抗病毒效应。本研究将在第三部分研究基础上进一步探讨:（1）C fiber是否通过作用AMs,促进RSV感染后IFN-α/β的产生,增强宿主抗病毒效应;（2）VIP能否增加RSV感染后AMs数量;（3）VIP调控RSV感染后AMs的数量变化的具体机制。方法:通过生物信息学分析KCF与Intact小鼠RSV感染后12h肺组织RNA-Seq数据,采用CIBERSORT预测免疫细胞浸润,流式细胞术检测AMs数量。脂质体去除KCF小鼠的AMs,流式验证小鼠AMs去除成功。予KCF及去除AMs的KCF小鼠RSV滴鼻,在RSV感染后12h,收集BALF,ELISA检测BALF中IFN-α/β的水平。予VIPhyb处理KCF小鼠,RSV感染后12h,流式细胞术检测肺泡巨噬细胞数量变化;予VIP处理Intact小鼠,RSV感染后12h,流式细胞术检测肺泡巨噬细胞的数量变化。体外予不同浓度VIP处理肺泡巨噬细胞系MH-S,于RSV感染后不同时间点采用流式细胞术检测MH-S的死亡及增殖情况。结果:免疫浸润分析及流式细胞术结果显示KCF小鼠较Intact小鼠RSV感染后12h肺组织AMs显著增高。耗竭KCF小鼠AMs,RSV感染后BALF中IFN-α/β水平显著降低。VIPhyb降低RSV感染KCF小鼠AMs的数量,而VIP增加RSV感染Intact小鼠AMs数量。体外不同浓度VIP能够不同程度上抑制RSV感染后MH-S凋亡和坏死,促进其增殖。结论:VIP通过促进RSV感染后AMs增殖,抑制其凋亡,增加RSV感染后AMs数量,增强宿主抗病毒效应。