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目的：
利用眼表生物膜固定装置(BMFD)固定羊膜(AM)制成的BMFD—AM接触镜在角膜缘干细胞缺损(limbal stem cell deficiency，LSCD)兔眼表注射人表皮干细胞(Epi—SCs)单细胞悬液，观察并评价其重建角膜上皮的可行性、有效性和安全性。
方法：
1.人表皮干细胞(Epi—SCs)的体外培养、纯化以及鉴定：取正常男性供体新鲜皮肤组织，采用消化法和Ⅳ型胶原黏附法获得并分选人表皮干细胞，体外原代培养。
2.原瓶粘附分选法获得20 min快吸附的表皮干细胞，制备浓缩的人表皮干细胞悬液(×107/ml)。利用激光共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope，LSCM)用免疫细胞荧光的方法从细胞水平检测K10、K19、K15的表达，鉴定筛选所得的人表皮干细胞。
3.用机械刮除法制作雌性新西兰兔角膜上皮及角膜缘干细胞缺损动物模型(n=60)并随机分为3组，每组20只：
BMFD—AM+ Epi—SCs组：利用眼表生物膜固定装置(BMFD)固定羊膜(AM)制成的BMFD—AM接触镜联合表皮干细胞单细胞悬液注射行眼表干细胞移植；
BMFD—AM组：行BMFD—AM接触镜治疗；
空白对照组：单纯药物滴眼治疗。
4.术后局部滴含双抗的表皮细胞培养液4-6次/日，0.15％环孢素A眼液2次/日，每晚结膜囊涂贝复舒(bFGF)眼膏。每3日更换羊膜，直至角膜完全上皮化。每日裂隙灯下观察角膜上皮修复、角膜透明度、新生血管、炎症反应等并评分，随访约2周。
5.病理组织及免疫组织化学检查：手术后当天，1天，3天、1周、2周，分别取材进行冰冻切片，行HE染色和免疫组织化学染色(P63、K1/10、K3/12、K4、Pax6、MUC5AC)
6.Y—STR基因检测：术后2周标本行Y—STR基因检测。
7.数据采用SPSS for Windows11.5统计软件处理，统计学方法为配对t检验和单因素方差分析，以P<0.05具有统计学显著性差异。
结果：
1、成功在体外无血清无饲养层培养体系下扩增原代人表皮干细胞，细胞呈球形体积小，核质比高、细胞器少，细胞在显微镜下折光性强，胞体透亮。
2、Ⅳ型胶原黏附法联合原瓶黏附分选法筛选得到的表皮干细胞呈K15和K19阳性，K1/K10阴性，并具有较强的增殖能力，传代后7天见细胞生长致密，体积较小，核浆比例较大。
3、BMFD—AM+ Epi—SCs组角膜上皮修复快，平均(5.60±0.46)d达到完全上皮化，而另外两组角膜上皮修复迟缓，完全上皮化时间为：BMFD—AM组(9.25±0.51)d，空白对照组(12.45±0.65)d，各组间均有明显统计学差异(P<0.05)。在角膜完全上皮化当日，角膜混浊程度评分(x±s)：BMFD—AM+Epi—SCs组0.45±0.11；BMFD—AM组1.70±0.21；空白对照组2.85±0.20，各组间均有明显统计学差异(P<0.05)。新生血管评分：BMFD—AM+ Epi—SCs组0.75±0.16：BMFD—AM组2.40±0.23；空白对照组2.65±0.17。BMFD—AM+Epi—SCs组与BMFD—AM组及空白对照组间均有明显统计学差异(P<0.05)，而单纯羊膜治疗组及对照组间无统计学差异。
4、组织病理学(HE染色)显示细胞移植治疗后角膜上皮逐渐恢复正常复层结构。对照组上皮结膜化，出现杯状细胞，角膜基质胶原纤维增殖，新生血管增生，炎症细胞浸润。
5、免疫组化染色显示细胞移植后的角膜区域上皮K3/K12(+)、K4(—)，MUC5AC(—)，K1/K10(—)，表明是角膜上皮表型，而两对照组角膜区域上皮MUC5AC(+)、K4(+)、K3/K12(—)，为结膜上皮表型。
6、移植男性人表皮干细胞的雌兔角膜完全上皮化后，PCR检测到男性Y—STR基因12个位点。
结论：
表皮干细胞是重建角膜上皮的理想种子细胞。BMFD—AM接触镜联合注射人表皮干细胞单细胞悬液在兔角膜缘干细胞缺损模型的上皮重建中疗效明确。此方法无需载体，操作非侵入性，简单易行，安全有效。