Ⅰ型干扰素作为一类重要的细胞因子,有着广泛的生物学功能,包括抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等。其中,Ⅰ型干扰素在激发抗病毒免疫应答中发挥着极其重要的作用。目前认为,Ⅰ型干扰素抗病毒的主要机制是通过诱导靶细胞产生某些抗病毒分子而获得对病毒感染的抵抗力,同时上调感染细胞MHCⅠ类分子的表达使其更好地被CTL识别进而使得感染细胞被杀伤、清除。此外,Ⅰ型干扰素还活化相应免疫细胞,能够显著地活化NK细胞,增强其杀伤功能,清除被病毒感染的细胞和转化的细胞。Ⅰ型干扰素是NK细胞最强有力的活化细胞因子之一,它能够迅速活化NK,提高其对靶细胞的杀伤能力。目前,对于Ⅰ型干扰素活化NK细胞的机制虽有许多研究,例如,有报道认为是通过Ⅰ型干扰素诱导白介素15的自分泌、旁分泌而起作用的,但是具体的详细作用机制尚不十分清楚。此外,Ⅰ型干扰素对NK功能的调控远不仅仅限于活化这么单一,其全面的作用尚需进一步深入认识与研究。在临床上,Ⅰ型干扰素被广泛应用在病毒感染性疾病的治疗中。然而,在不同的人中Ⅰ型干扰素的治疗效果差异很大。目前Ⅰ型干扰素功能的实现和信号通路的研究已经相当深入,但是Ⅰ型干扰素对不同细胞实现其功能的机制尚没有完全的了解。目前的研究证实,JAK/STAT级联信号传导,这一被广泛接受的经典的Ⅰ型干扰素信号传导通路,受到多重机制的严密调控。其中,抑制性的信号分子,如SOCS家族,能负向调控Ⅰ型干扰素信号传导。最终,Ⅰ型干扰素的信号传导改变了细胞内数百种基因的表达,通过这些调控的基因,Ⅰ型干扰素实现对细胞功能的调控。Micro-RNAs (miRNA)是细胞内一类表达丰富、非编码的高度保守的小RNA,长度为18-25 nt。miRNAs表现出一种转录后调控基因表达的全新机制,它通过结合靶基因的mRNA的3’UTR抑制基因的表达。miRNAs已经被证实在发育、感染、免疫应答、炎症反应和肿瘤的发生等多种生理与病理过程中发挥作用。从最初发现到现在,已经在哺乳动物中发现了700多个miRNAs,其中绝大部分miRNAs的生物学功能是未知的。已有报道,miRNAs参与免疫应答中多方面的调控作用。但目前为止,尚未见报道miRNAs能够调控Ⅰ型干扰素的信号通路进而影响抗病毒天然免疫,也没有报道miRNAs参与到Ⅰ型干扰素对免疫细胞功能的调控作用。对于NK细胞的活化,Ⅰ型干扰素刺激是不是也会通过一种niRNAs依赖的方式参与其中呢?这有待于进一步的研究。通过转基因或基因敲除小鼠实验,miR-155已被证实在体液免疫和细胞免疫中发挥着不可或缺的作用。而对于天然免疫和炎症反应,miR-155能够被多种刺激所诱导表达,例如TLRs激动剂(例如TLR2, TLR3, TLR4和TLR9配体)、细胞因子(IL-1,TNF-α和IFN-β等)的刺激均可诱导其表达,提示miR-155可能参与天然免疫反应。尽管miR-155表达能够被poly (I:C)或IFN-β诱导的事实强烈提示miR-155参与了抗病毒免疫应答,但目前还没有关于miR-155调控抗病毒天然免疫应答或miR-155调控Ⅰ型干扰素信号通路和Ⅰ型干扰素激发的抗病毒免疫的报道。正是基于以上研究背景,我们利用miRNAs表达芯片和高通量的小RNA测序技术,分别研究了小鼠巨噬细胞在VSV病毒感染后miRNA的表达变化,和人外周血NK细胞在Ⅰ型干扰素活化之后不同时间小RNA的表达谱变化。我们发现巨噬细胞在感染VSV病毒后miR-155是变化最明显的一个；NK细胞在被Ⅰ型干扰素活化后miRNA总体发生了轻微的下降,其中有几个下降比较明显。第一部分：miR-155通过抑制SOCS1的表达而增强Ⅰ型干扰素的信号传导和促进其抗病毒效应(一)VSV感染诱导巨噬细胞上调miR-155依赖于RIG-I/JNK/NF-κB而非依赖于TLR/MyD88通路我们研究了miR-155上调的机制。已经报道过,来自TLR2、TLR3、TLR4和TLR9信号能够通过MyD88和TRIF依赖的方式诱导miR-155的表达。我们发现TLR3、TLR4、TLR9或MyD88缺陷小鼠的腹腔巨噬细胞在VSV感染之后miR-155的表达没有变化,这样就排除了TLR信号在miR-155上调的作用。然而,RIG-I缺陷的小鼠巨噬细胞和脾脏细胞中VSV很难诱导miR-146a和miR-155的表达,说明它们的诱导是RIG-I依赖的。作为对照,LPS诱导的miR-155的表达在RIG-Ⅰ缺陷的细胞中没有影响,而在TLR4缺陷的细胞中严重不足。有报道证明miR-155的表达依赖JNK,所以我们研究了JNK和NF-κB的抑制剂对两者表达的影响。我们发现,抑制JNK和NF-κB能够抑制VSV诱导的miR-155的表达上调,然而,p38和ERK的抑制对其表达没有影响。(二)VSV诱导miR-155的表达能够通过增强Ⅰ型干扰素信号通路而抑制病毒复制为了进一步研究miR-155上调在病毒感染中的生物学意义,我们检测了miR-155对巨噬细胞中病毒复制的影响。通过检测被感染巨噬细胞培养上清中VSV的TCIDso,我们发现抑制miR-155能够促进VSV的复制,高表达miR-155能够抑制VSV的复制。同时,我们也检测了胞内VSV病毒RNA的拷贝量,其结果与VSV的TCID50一致。为了探索这一现象的机制,验证VSV触发的miR-155上调是否能够影响VSV所触发的巨噬细胞的天然免疫应答,我们研究了miR-155对VSV感染触发的Ⅰ型干扰素的产生的影响。我们发现miR-155并不像我们之前报道的miR-146a那样能够调控Ⅰ型干扰素的产生,蛋白水平和mRNA水平的分析均表明,miR-155高表达和抑制对VSV诱导的Ⅰ型干扰素的产生都没有明显的影响。于是我们把视线转向了Ⅰ型干扰素触发的信号传导和效应。VSV感染可在巨噬细胞中引起STAT1的磷酸化,并在感染后24小时到达最高峰。我们发现VSV引起的STAT1的磷酸化能够被miR-155的高表达所促进,而被miR-155的抑制所减弱。我们也检测了干扰素所诱导的效应基因ISG15和IP10的表达,在用重组的IFN-β刺激的巨噬细胞中,我们发现ISG15和IP10同样被miR-155的高表达所促进,而被miR-155的抑制所抑制。所以,RNA病毒诱导的miR-155的表达能够增强Ⅰ型干扰素的信号传导从而促进Ⅰ型干扰素的抗病毒效应,而对Ⅰ型干扰素的产生没有显著影响。(三)miR-155通过抑制靶基因SOCS1的表达而增强Ⅰ型干扰素的信号传导和促进其抗病毒效应接下来我们研究miR-155通过作用于哪个靶分子发挥调控Ⅰ型干扰素的信号传导的作用。通过TargetScan (http://www.targetscan.org)预测软件,我们发现miR-155在SOCS1的3’UTR有一个序列保守的潜在的靶位点。SOCS1已被证实可以负向调节多种免疫应答和信号通路,包括Ⅰ型干扰素的信号传导。而且,在VSV感染不到24小时内,SOCS1的mRNA水平迅速升高,但它的蛋白水平没有多大的变化甚至还有点下降,这提示在巨噬细胞中SOCS1的表达存在转录后的调控的机制,而这很可能就是miRNA的作用机制。所以,我们推测在VSV刺激的巨噬细胞中miR-155的上调可能抑制了SOCS1的翻译。于是,我们检测了SOCS1的表达是否受细胞中miR-155水平的影响。结果发现,miR-155被抑制后SOCS1的表达上升,而miR-155高表达后SOCS1的表达下降。在VSV感染的动态过程中,转染miR-155抑制剂的巨噬细胞与对照组相比SOCS1的蛋白表达量表现出与mRNA水平一致的上升趋势,直接证明了miR-155在病毒感染中抑制SOCS1的作用。为了证明miR-155对Ⅰ型干扰素信号传导的影响是在SOCS1这个点上起作用,我们在重组IFN-p刺激巨噬细胞后动态监测了Ⅰ型干扰素信号传导通路各个节点的磷酸化情况,得到了一致的结论。这一结果与之前报道的报告基因的结果相吻合,即证实miR-155能够直接作用于SOCS1的3’UTR的保守的靶位点抑制其表达。所以,在巨噬细胞中上调的miR-155能够直接作用于SOCS1并抑制其表达。为了证明miR-155的抗病毒效应就是通过抑制靶分子SOCS1实现的,我们做了SOCS1的siRNA干扰抑制实验和高表达实验。首先我们验证了干扰实验和高表达实验的效率和可靠性。我们发现在巨噬细胞中SOCS1干扰表达之后能够像高表达miR-155一样抑制VSV病毒的复制,而miR-155的抑制对VSV病毒复制的促进作用能够被SOCS1的干扰所逆转。而且,抑制miR-155对重组IFN-β诱导ISG15的阻碍作用也能在SOCS1干扰之后恢复。所以,SOCS1干扰与诱导的miR-155的抗病毒效应相一致,并能拮抗抑制miR-155的效果,因为我们构建的高表达SOCS1的RAW264.7稳转细胞系表达的SOCS1的mRNA不含有它的3’UTR,所以miR-155也就不再能够调控SOCS1的表达进而发挥其抗病毒作用了。通过检测细胞培养上清VSV TCID50和胞内VSVRNA拷贝量,进一步证实在稳定表达SOCS1的RAW264.7细胞中miR-155高表达不再影响VSV的复制。所以,我们认为在病毒感染中被诱导上调的miR-155通过抑制内源性靶分子SOCS1的表达进而促进Ⅰ型干扰素的信号传导、促进其发挥抗病毒的生物学功能。第二部分：Ⅰ型干扰素活化的人NK细胞small RN A的表达谱变化及相关功能分析我们用流式分选正常人外周血CD56+NK细胞,其纯度在95%以上。在用人重组α干扰素分别刺激0小时、12小时和24小时后,抽提RNA,用Illumina Solexa大规模测序技术对人NK细胞的小RNA成分(18-30nt)进行测序并进行了初步分析。(一)small RNA测序结果概述对测序所得的35 nt原始reads做去接头,去低质量reads,去污染等处理,得到高质量的测序reads,称为clean reads,后续分析均以此为基础。首先对小RNA做长度分布统计,一般来说,miRNA集中在21或22nt,siRNA集中在24nt,piRNA集中在30nt。三个时间点的结果显示,small RNA均在22nt位置呈现出明显的单峰结构,说明其大多数为miRNA。序列差异分析表明,三个样本没有太大的变化,约93%一致,说明small RNAs在Ⅰ型干扰素活化NK细胞的过程中变化不大。与基因组的序列比对显示,三个样本中约80%的序列能在基因组上定位。与miRNA数据库(miRBase14.0)中人miRNA前体序列进行比对,得到样本中已知的miRNA的量,分别为61.8%(O小时),44.0%(12小时),55.1%(24小时),可以看出miRNA的比例在干扰素刺激后表现出了轻微的下降趋势。(二)miRNAs表达分析将每个miRNA的量统一标准化为转录数每1M reads (TPM)后,我们得到了正常人NK细胞的miRNAs表达谱。在静息NK细胞中,有11个miRNAs的TPM＞10000,has-miR-21, has-let-7f, has-let-7a, has-miR-140-3p, has-miR146b-5p, has-let-7g, has-142-3p, has-miR-101, has-miR-378, has-let-7b, and has-miR-103。其总量之和占small RNA的47.3%左右,miRNA总量的76.8%,提示其可能在NK细胞中的重要作用。在去除低拷贝的miRNA (TPM<100)之后,我们发现大多数miRNAs表现出了下降的趋势,其中24个明显下降(小于0.5倍),也有少数miRNAs在Ⅰ型干扰素活化后上升,其中2个miRNAs显著上升(大于2倍)。随后我们用real-time PCR的方法在15例重组α干扰素刺激的人NK细胞RNA样本中验证了测序的结果。(三)差异miRNAs的靶分子预测与功能设想我们利用TargetScan (http://www.targetscan.org)和Mirenda (http://www.microma.org/microma/home.do)预测软件对变化显著的：miRNA进行了靶分子预测,发现其中有3个下降显著的miRNA, miR-378、miR-30家族和miR-150能够靶向调控NK细胞杀伤效应分子颗粒酶素B和穿孔素。已有学者研究表明,小鼠NK细胞在细胞因子活化后,包括Ⅰ型干扰素活化后,可以通过转录后的机制上调表达其杀伤效应分子颗粒酶素B和穿孔素。我们在本部分实验中发现人外周血NK细胞在Ⅰ型干扰素活化之后也会上调效应分子颗粒酶素B和穿孔素的表达,而其mRNA水平没有明显变化。于是我们提出这样的假设,Ⅰ型干扰素通过下调miR-378、miR-30家族和miR-150的表达,来解除这三种miRNAs对颗粒酶素B和穿孔素的翻译抑制作用,从而上调颗粒酶素B和穿孔素表达,进而增强NK细胞的杀伤功能。这可能是Ⅰ型干扰素调控人NK细胞杀伤功能的一种新机制。(四)新miRNA候选基因的预测将clean reads序列做分类注释,我们获得样品中各类小RNA的表达信息,其包括miRNAs, rRNA, tRNA, scRNA, snRNA, snoRNA,重复序列相关小RNA, mRNA相关RNA和未注释的小RNA。除表达量最高的miRNAs之外,其次就是未注释的小RNA(15.7%-19.6%)。我们用此来预测(?)ovel miRNA。利用miRNA预测软件Mireap,我们发现了一些新的miRNA候选基因(0小时样本,621条；12小时样本,554条；24小时样本,577条)。其中,拷贝数在至少一个样本中大于100且至少在两个样本中出现的最可能的新miRNA共11条,其功能有待进一步研究。结论：1、VSV感染能够通过RIG-I/JNK/NF-κB通路明显诱导巨噬细胞上调miR-155的表达,上调表达的miR-155能够通过增强Ⅰ型干扰素信号通路而增强了Ⅰ型干扰素抑制病毒复制的效应,但对于病毒诱导的Ⅰ型干扰素的产生没有影响；进一步研究分析表明, miR-155通过抑制内源性靶分子SOCS1的表达而促进Ⅰ型干扰素的信号传导、进而促进了Ⅰ型干扰素发挥抗病毒的生物学效应功能。2、用Illumina Solexa大规模测序技术对Ⅰ型干扰素刺激活化前后的人NK细胞的小RNA成分进行了测序和分析,得到了人NK细胞中小RNA和miRNA的表达谱,确证了一组Ⅰ型干扰素刺激活化NK细胞后表达改变的miRNA,发现了一批新的miRNAs候选基因,并对表达变化的miRNA做了相关功能预测。