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多溴联苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是溴代阻燃剂(brominated flameretardants, BFRs)类化合物的一种,是一种新型的持久性有机污染物(Persistant Organic Pollutants, POPs),因其添加量少、热稳定性好、阻燃效率高、对材料性能影响小、价格低廉等众多优点而广泛被应用于社会生产及生活的多个领域。目前PBDEs广泛存在于多种环境介质和人体生物材料中,且含量呈现逐年增加的趋势。体内和体外实验均发现,PBDEs暴露可导致多种健康危害,包括肝脏毒性、生殖毒性、神经毒性及神经发育毒性、内分泌干扰作用及致癌作用等。肿瘤抑制因子p53(tumor suppression factor p53)基因被称为人类基因组卫士,是细胞内重要的抑癌基因之一,其编码产物为53 kD的P53蛋白。野生型P53蛋白是细胞内重要的细胞周期“监控器”,正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用,当细胞内发生DNA损伤,野生型P53蛋白可介导细胞周期的阻滞,同时进行细胞内DNA修复,若修复无效则通过启动凋亡机制诱导受损细胞发生凋亡。研究显示,多数肿瘤中可发现p53基因的突变,发生突变的p53基因由抑癌基因转变为癌基因,编码产物为突变型P53蛋白,其细胞周期监测功能完全丧失,并且可以抑制野生型P53蛋白的正常功能,从而导致受损细胞异常增殖,并最终导致正常细胞转变为癌细胞。细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD),是指细胞为了维护内环境稳定,由基因调控的细胞自主的有序死亡。有研究显示,一定剂量的2,2’,4,4’-四溴联苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenylether, PBDE-47)可诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞发生凋亡。本实验室前期研究也显示,在PBDE-47诱导SH-SY5Y细胞凋亡过程中,Fas、细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)表达水平增高,Pro-Caspase 8及Pro-Caspase 3细胞内水平下降。研究已证实,与PBDEs结构相近的多氯联苯(Polychorinated biphenyls ethers, PCBs)能够引起细胞内P53蛋白表达水平增高,并引发p53依赖性凋亡通路的激活。是否PBDE-47亦能同样引起SH-SY5Y细胞P53蛋白表达水平增高尚无定论,仍需进一步研究。DNA甲基化修饰是表观遗传学(Epigenetics)中十分重要的一种修饰方式,是由DNA甲基转移酶( DNA methytransferse, Dnmts )催化,将S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供的甲基转移至DNA中CpG二核苷酸中的胞嘧啶上的第五位碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶(5-methyleytosine,5mC)的过程。目前研究认为,DNA甲基化可使基因发生沉默,降低其表达水平,而去甲基化改变则与之相反,可使已甲基化沉默的基因重新获得表达。鉴于PBDE-47是否引起神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞内p53 mRNA和蛋白表达水平增高及p53基因去甲基化改变的情况尚未见文献报道。因此,本研究拟通过体外培养SH-SY5Y细胞,并处以不同剂量的PBDE-47,观察p53基因及蛋白表达水平的变化及p53基因启动子区的去甲基化改变情况,从而探讨p53在PBDE-47所致的SH-SY5Y细胞凋亡中的作用。第一部分PBDE-47对SH-SY5Y细胞p53 mRNA及蛋白表达水平的影响目的探讨PBDE-47对SH-SY5Y细胞p53 mRNA及蛋白表达水平的影响。方法体外培养的SH-SY5Y细胞并暴露于不同浓度的PBDE-47(1, 5, 10μmol/L),以二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂对照,染毒24 h后,使用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测p53 mRNA表达水平变化,同时使用Western Blot技术检测P53蛋白表达水平的改变。结果Real-time PCR结果显示1、5μmol/L染毒组p53 mRNA表达水平显著高于对照组(p<0.05);10μmol/L染毒组p53 mRNA表达水平显著高于对照组及1、5μmol/L染毒组(p<0.05)。Western Blot结果显示,5μmol/L染毒组P53蛋白表达水平显著高于对照组及1μmol/L染毒组(p<0.05);10μmol/L染毒组P53蛋白表达水平显著高于对照组及1μmol/L、5μmol/L染毒组(p<0.05)。结论一定剂量的PBDE-47可导致SH-SY5Y细胞内p53 mRNA和蛋白表达水平的升高。第二部分PBDE-47对SH-SY5Y细胞p53基因启动子区甲基化水平的影响目的探讨PBDE-47染毒后SH-SY5Y细胞中p53基因基础启动子的甲基化水平变化情况。方法亚硫酸氢钠修饰PBDE-47染毒24 h后的SH-SY5Y细胞基因组DNA,针对p53启动子区设计特异性引物,应用PCR技术扩增修饰后的启动子区,扩增产物纯化后进行克隆测序。结果实验设计p53基因启动子扩增产物255 bp。测序结果显示,对照组p53基因基础启动子区中9个待检测C均转变为T;1,5,10μmol/L染毒组基础启动子区中9个待检测胞嘧啶(C)均转变为胸腺嘧啶(T)。结论PBDE-47染毒后的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中p53 mRNA转录水平的增高尚不能确定与其启动子区的去甲基化机制相关。