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研究背景及目的
血管生成与恶性肿瘤的生长及转移密切相关,肿瘤直径大于2 mm时,通过新生血管输送足够的养分和排除代谢废物,并为转移提供便利。
血管生成需多种因子的参与,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)信号通路是主要的限速环节,且VEGFR-2(KDR)是发挥血管生成生物学作用的主要受体类型,其在正常组织和良性肿瘤组织不表达或低表达,而在恶性肿瘤组织中呈高水平表达。针对多种恶性肿瘤的免疫组化研究显示,KDR主要表达于新生血管内皮细胞,某些肿瘤细胞本身也高表达该受体。
在胞膜受体高表达的肿瘤中,选择性受体靶向的放射性多肽已成为一类重要的分子显像和治疗放射性药物。这种被发射γ射线的核素标记多肽可与受体结合,进而达到无创探测表达有该受体的肿瘤的目的。
近年来,噬菌体展示技术及核糖体展示技术的出现为寻找VEGFR特异性结合物提供了一个新的途径。该技术用已知受体在高通量噬菌体肽库或核糖体肽库中进行筛选,可保证筛选出的多肽与受体高特异性及高亲和力结合。K237即是应用该技术筛选出的十二肽,研究证实,K237可阻断VEGF与KDR的结合,抑制VEGF介导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及绒毛膜尿囊膜的血管生成,并可抑制SCID小鼠BICR-H1系乳腺癌细胞的生长和转移。
本实验研究通过对K237进行99Tcm标记,探索其作为KDR受体导向的恶性实体瘤分子显像剂的可行性,并为日后开展放射性核素内照射治疗研究提供实验基础。
方法
1.99Tcm-MAG3-K237的制备:采用酒石酸亚锡还原法制备99Tcm-MAG3-K237,3MM色谱纸层析测定放射化学纯度,应用正交试验设计方法筛选最佳标记条件。
2.99Tcm-MAG3-K23的体外稳定性鉴定:通过室温稳定性、半胱氨酸置换和三氯乙酸蛋白沉淀等体外稳定性实验,评价99Tcm-MAG3-K237的理化性质。
3.99Tcm-MAG3-K237在健康家兔体内的示踪动力学分析:取6只日本雄性大耳兔,经耳缘静脉注射37 MBq99Tcm-MAG3-K237溶液,然后分别于1.5、3、5、10、30、60、120、240、480 min从对侧耳缘静脉取血,称重并测量放射性计数,结果经测量效率校正,计算放射性浓度(KBq/L)。运用药代动力学分析软件DAS2.1.1版判断最佳房室模型,并得出药代动力学参数。
4.99Tcm-MAG3-K237的健康动物体内分布及显像研究:将7.4.MBq99Tcm-MAG3-K237溶液稀释至500 ml,分别取1 ml加入至5只放免试管中,将测得的放射性计数(cpm)的均数乘以500,即得到参考源的放射性计数。取35只成年昆明小鼠,按随机数字表法分为7组,每组5只。经尾静脉注射7.4 MBq99Tcm-MAG3-K237溶液,分别于1、5、10、30、60、120、240 min摘眼球法取血,然后将小鼠以颈椎脱臼法处死,收集心、肺、肝、肾、肠、肌肉、骨、脑,分别称重并测量放射性计数,经参考源校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g)。家兔固定于木制板上,注射99Tcm-MAG3-K237溶液37 MBq后立即以1帧/min采集60 min,并于90、120、180、240 min预置计时2 min各采集图像1帧,观察各器官的放射性分布动态变化。
5.99Tcm-MAG3-K237的荷HepG2裸鼠体内分布研究:将7.4 MBq99Tcm-MAG3-K237溶液稀释至500 ml,分别取1 ml加入至5只放免试管中,将测得的放射性计数(cpm)的均数乘以500,即得到参考源的放射性计数。取15只荷HepG2裸鼠,按随机数字表法分为5组。经尾静脉注射7.4.MBq99Tcm-MAG3-K237溶液,分别于10、30、60、120、240 min通过摘除眼球采集血液,然后将小鼠以颈椎脱臼法处死,收集心、肺、肝、肾、肠、肌肉、骨、脑、肿瘤,分别称重并测量放射性计数(cpm),经参考源校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g),并计算各时相的T/NT比值。
6.99Tcm-MAG3-K237荷瘤裸鼠显像及竞争结合显像研究:取荷HepG2裸鼠固定于木制板上,尾静脉注射99Tcm-MAG3-K237溶液17.5 MBq后分别于30、60、90、120、180、240 min各预置计时2 min采集图像1帧,观察肿瘤组织放射性分布动态变化。取另一只荷瘤裸鼠,尾静脉注射混有0.5 mg MAG3-K237的99Tcm-MAG3-K237溶液17.5MBq,观察MAG3-K237对肿瘤显像的抑制作用。
结果
1.99Tcm-MAG3-K237的制备:99Tcm标记MAG3-K237(20μg)的最佳反应条件为:0.25 mol/L醋酸铵缓冲液(pH5.2)、16μg酒石酸钾钠、4μg酒石酸亚锡、37 MBq99TcmO4-,总反应体积182μl,充氮、密封条件下于沸水浴中加热30 min。Whatmann3MM纸层析,γ计数器测量标记混合物各放射性组分在生理盐水、氨水及丙酮3种流动相中的比移值(Rf值)。本方法制备的99Tcm-MAG3-K237的标记率为(97.98±0.76)％,直接法计算其比活度为(3.54±0.03)TBq/mmol。
2.99Tcm-MAG3-K23的体外稳定性:标记物室温下放置8 h,标记率仍大于95％,为(96.15±0.37)％;不同浓度半胱氨酸置换实验,99Tcm-MAG3-K237中未结合99Tcm的变化均小于1％;三氯乙酸沉淀实验显示99Tcm-MAG3-K237与血清蛋白无明显结合。
3.99Tcm-MAG3-K237在健康家兔体内的示踪动力学分析:标记多肽的家兔体内动力学过程符合权重为1/c2的三室模型,t1/2α为4.00±3.53 min,t1/2β为24.48±9.84 min,t1/2γ为852.24±444.00 min,清除率(CL)为1.83±0.41 ml/min。
4.99Tcm-MAG3-K237在健康动物体内的生物分布及显像:标记物在健康小鼠体内清除迅速,肾脏、肝脏及肠道分布较多,但肝脏30 min后分布很少。
5.99Tcm-MAG3-K237荷瘤裸鼠体内分布及显像:荷HepG2裸鼠体内分布显示,10 min时相肿瘤组织摄取放射性最高,为(0.90±0.18)(％ID/g);肿瘤与对侧肌肉放射性比值(T/NT)1h达最高值,为2.19±0.22:肾脏、肝脏及肠道放射性分布较多。荷HepG2裸鼠SPECT显像中,肿瘤1 h显影最清晰,MAG3-K237阻断后,肿瘤影像明显减淡。
结论
1.本研究制备的99Tcm-MAG3-K237标记率＞95％,勿需分离纯化直接应用,具有良好的体内外稳定性。
2.99Tcm-MAG3-K237在健康动物体内具有良好的体内分布及示踪动力学特性,血液清除快,通过肾脏及肝脏双重途径排泄。
3.99Tcm-MAG3-K237特异性浓聚于荷瘤裸鼠肿瘤组织,肿瘤显像清楚,且T/NT比值较高,是一具有潜在应用价值的肿瘤KDR分子显像剂。
血管生成与恶性肿瘤的生长及转移密切相关,肿瘤直径大于2 mm时,通过新生血管输送足够的养分和排除代谢废物,并为转移提供便利。
血管生成需多种因子的参与,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)信号通路是主要的限速环节,且VEGFR-2(KDR)是发挥血管生成生物学作用的主要受体类型,其在正常组织和良性肿瘤组织不表达或低表达,而在恶性肿瘤组织中呈高水平表达。针对多种恶性肿瘤的免疫组化研究显示,KDR主要表达于新生血管内皮细胞,某些肿瘤细胞本身也高表达该受体。
在胞膜受体高表达的肿瘤中,选择性受体靶向的放射性多肽已成为一类重要的分子显像和治疗放射性药物。这种被发射γ射线的核素标记多肽可与受体结合,进而达到无创探测表达有该受体的肿瘤的目的。
近年来,噬菌体展示技术及核糖体展示技术的出现为寻找VEGFR特异性结合物提供了一个新的途径。该技术用已知受体在高通量噬菌体肽库或核糖体肽库中进行筛选,可保证筛选出的多肽与受体高特异性及高亲和力结合。K237即是应用该技术筛选出的十二肽,研究证实,K237可阻断VEGF与KDR的结合,抑制VEGF介导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及绒毛膜尿囊膜的血管生成,并可抑制SCID小鼠BICR-H1系乳腺癌细胞的生长和转移。
本实验研究通过对K237进行99Tcm标记,探索其作为KDR受体导向的恶性实体瘤分子显像剂的可行性,并为日后开展放射性核素内照射治疗研究提供实验基础。
方法
1.99Tcm-MAG3-K237的制备:采用酒石酸亚锡还原法制备99Tcm-MAG3-K237,3MM色谱纸层析测定放射化学纯度,应用正交试验设计方法筛选最佳标记条件。
2.99Tcm-MAG3-K23的体外稳定性鉴定:通过室温稳定性、半胱氨酸置换和三氯乙酸蛋白沉淀等体外稳定性实验,评价99Tcm-MAG3-K237的理化性质。
3.99Tcm-MAG3-K237在健康家兔体内的示踪动力学分析:取6只日本雄性大耳兔,经耳缘静脉注射37 MBq99Tcm-MAG3-K237溶液,然后分别于1.5、3、5、10、30、60、120、240、480 min从对侧耳缘静脉取血,称重并测量放射性计数,结果经测量效率校正,计算放射性浓度(KBq/L)。运用药代动力学分析软件DAS2.1.1版判断最佳房室模型,并得出药代动力学参数。
4.99Tcm-MAG3-K237的健康动物体内分布及显像研究:将7.4.MBq99Tcm-MAG3-K237溶液稀释至500 ml,分别取1 ml加入至5只放免试管中,将测得的放射性计数(cpm)的均数乘以500,即得到参考源的放射性计数。取35只成年昆明小鼠,按随机数字表法分为7组,每组5只。经尾静脉注射7.4 MBq99Tcm-MAG3-K237溶液,分别于1、5、10、30、60、120、240 min摘眼球法取血,然后将小鼠以颈椎脱臼法处死,收集心、肺、肝、肾、肠、肌肉、骨、脑,分别称重并测量放射性计数,经参考源校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g)。家兔固定于木制板上,注射99Tcm-MAG3-K237溶液37 MBq后立即以1帧/min采集60 min,并于90、120、180、240 min预置计时2 min各采集图像1帧,观察各器官的放射性分布动态变化。
5.99Tcm-MAG3-K237的荷HepG2裸鼠体内分布研究:将7.4 MBq99Tcm-MAG3-K237溶液稀释至500 ml,分别取1 ml加入至5只放免试管中,将测得的放射性计数(cpm)的均数乘以500,即得到参考源的放射性计数。取15只荷HepG2裸鼠,按随机数字表法分为5组。经尾静脉注射7.4.MBq99Tcm-MAG3-K237溶液,分别于10、30、60、120、240 min通过摘除眼球采集血液,然后将小鼠以颈椎脱臼法处死,收集心、肺、肝、肾、肠、肌肉、骨、脑、肿瘤,分别称重并测量放射性计数(cpm),经参考源校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g),并计算各时相的T/NT比值。
6.99Tcm-MAG3-K237荷瘤裸鼠显像及竞争结合显像研究:取荷HepG2裸鼠固定于木制板上,尾静脉注射99Tcm-MAG3-K237溶液17.5 MBq后分别于30、60、90、120、180、240 min各预置计时2 min采集图像1帧,观察肿瘤组织放射性分布动态变化。取另一只荷瘤裸鼠,尾静脉注射混有0.5 mg MAG3-K237的99Tcm-MAG3-K237溶液17.5MBq,观察MAG3-K237对肿瘤显像的抑制作用。
结果
1.99Tcm-MAG3-K237的制备:99Tcm标记MAG3-K237(20μg)的最佳反应条件为:0.25 mol/L醋酸铵缓冲液(pH5.2)、16μg酒石酸钾钠、4μg酒石酸亚锡、37 MBq99TcmO4-,总反应体积182μl,充氮、密封条件下于沸水浴中加热30 min。Whatmann3MM纸层析,γ计数器测量标记混合物各放射性组分在生理盐水、氨水及丙酮3种流动相中的比移值(Rf值)。本方法制备的99Tcm-MAG3-K237的标记率为(97.98±0.76)％,直接法计算其比活度为(3.54±0.03)TBq/mmol。
2.99Tcm-MAG3-K23的体外稳定性:标记物室温下放置8 h,标记率仍大于95％,为(96.15±0.37)％;不同浓度半胱氨酸置换实验,99Tcm-MAG3-K237中未结合99Tcm的变化均小于1％;三氯乙酸沉淀实验显示99Tcm-MAG3-K237与血清蛋白无明显结合。
3.99Tcm-MAG3-K237在健康家兔体内的示踪动力学分析:标记多肽的家兔体内动力学过程符合权重为1/c2的三室模型,t1/2α为4.00±3.53 min,t1/2β为24.48±9.84 min,t1/2γ为852.24±444.00 min,清除率(CL)为1.83±0.41 ml/min。
4.99Tcm-MAG3-K237在健康动物体内的生物分布及显像:标记物在健康小鼠体内清除迅速,肾脏、肝脏及肠道分布较多,但肝脏30 min后分布很少。
5.99Tcm-MAG3-K237荷瘤裸鼠体内分布及显像:荷HepG2裸鼠体内分布显示,10 min时相肿瘤组织摄取放射性最高,为(0.90±0.18)(％ID/g);肿瘤与对侧肌肉放射性比值(T/NT)1h达最高值,为2.19±0.22:肾脏、肝脏及肠道放射性分布较多。荷HepG2裸鼠SPECT显像中,肿瘤1 h显影最清晰,MAG3-K237阻断后,肿瘤影像明显减淡。
结论
1.本研究制备的99Tcm-MAG3-K237标记率＞95％,勿需分离纯化直接应用,具有良好的体内外稳定性。
2.99Tcm-MAG3-K237在健康动物体内具有良好的体内分布及示踪动力学特性,血液清除快,通过肾脏及肝脏双重途径排泄。
3.99Tcm-MAG3-K237特异性浓聚于荷瘤裸鼠肿瘤组织,肿瘤显像清楚,且T/NT比值较高,是一具有潜在应用价值的肿瘤KDR分子显像剂。