家蚕是鳞翅目的模式昆虫,且具有重要的经济价值,但其细胞凋亡的研究尚处于初级阶段。家蚕基因组框架图、精细图的完成及本实验室拥有的多个基因突变品系和细胞系,为其凋亡网络的研究提供了资源。Caspase基因作为细胞凋亡网络中的关键因子,一直受到广泛关注。目前,已报道了包括家蚕ice在内的4种鳞翅目昆虫的多个Caspase。本实验通过生物信息学和分子生物学技术克隆了家蚕胚胎细胞内新的Caspase同源物Bmcaspase-N,对其在凋亡细胞内表达量进行了实时定量分析,并对该基因进行了原核表达和RNAi实验,得到了以下研究结果:　　 1.家蚕凋亡基因Bmcaspase-N的信息分析及全长克隆。　　 本实验在家蚕基因组数据库的基础上,对Bmcapase-N基因的信息分析显示,该基因位于家蚕第20号染色体的nscaf2795上。通过片段克隆、测序、拼接,获得了cDNA全长序列2105bp,包含完整的开放阅读框ORF,ORF长1494bp,包含5个外显子,编码497个氨基酸,蛋白的分子量大小为57.SkDa,等电点为5.29。在第138个氨基酸到第379个氨基酸之间,有一个称为CASc的保守结构域,包含大小亚基,特异的五肽结构QACRG位于第247～258个氨基酸之间。在对Bmcapase-N的ORF克隆中,除了Bmcaspase-N外,另克隆到一个该基因的同源体,分别命名为Bmcaspase-N1和Bmcaspase-N2。Bmcaspase-N2比Bmcaspase-N1的序列短,OKF长1239bp,前导结构域,大小亚基完全相同,仅在功能结构域以后的序列存在差别。推测这两个片段可能是Bmcaspase-N基因的两种不同剪切体。　　 对Bmcaspase-N1和占Bmcaspase-N2在凋亡细胞内的表达量进行实时荧光定量检测,发现相对于在正常细胞的表达量而言,两基因在凋亡细胞中均出现表达量降低的情况,但变化不显著,特别是Bmcaspase-N2,基本无变化。　　 2.Bmcapase-N的原核表达和活性测定。　　 将Bmcapase-N基因中编码第131～379个氨基酸残基的基因片段亚克隆到Pet-28a-c(+)原核表达载体上,转化Rosetta宿主菌后用IPTG诱导表达。提取目的蛋白,分别与Caspase-1,Caspase-3,Caspase-9的特异性四肽底物YVAD、DEVD、LEHD反应后,通过分光光度法,检测其在405nm附近的吸光度值,结果无明显差别,无法判断该基因所属的Caspase类别。　　 3.Bmcapase-N的RNAi研究。　　 通过dsRNA介导的RNAi技术,对家蚕胚胎细胞BmE-SWU1进行Bmcapase-N基因沉默。转染细胞48h后进行细胞流式分析,结果显示,干涉后的细胞凋亡率无明显差别,初步推测该基因可能具有凋亡以外的其他功能。