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规律成簇间隔短回文重复（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）核酸酶基因编辑系统是新一代基因组编辑技术,具有操作简单和效率高等优点,广泛应用于植物基因功能研究和遗传改良。目前应用最广的CRISPR相关蛋白9（CRISPR-associated endonuclease 9,Cas9）基因编辑系统受到前间区序列邻近基序（Protospacer adjacent motif,PAM）为NGG的限制,靶点选择范围有待进一步拓展,而且偶有脱靶事件报道。动物研究中CRISPR相关蛋白12a（CRISPR-associated endonuclease 12a,Cas12a）基因编辑系统（也称作Cpf1）和CRISPR-x Cas9系统的出现,极大提高了靶点选择范围,而在植物中尚鲜有报道。本研究开发了植物CRISPR-Cpf1p（CRISPR-Cpf1 plant）和CRISPR-x Cas9p（CRISPR-x Cas9 plant）基因编辑系统,并运用开发的系统成功敲除了6个水稻抗病负调控基因,创制了水稻抗病材料。主要结果如下:1.通过对Francisella novicida U112 Cpf1（Fn Cpf1）和Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cpf1（Lb Cpf1）的密码子进行优化,使其符合植物基因偏好性,命名为Fn Cpf1p和Lb Cpf1p,并将它们与p Ubi启动子连接,整合到含真核筛选标记的双元载体,形成p YLCRISPR/Cpf1p系列载体。2.构建了适合PCR扩增方法拼接cr RNA（CRISPR-derived RNA）表达盒的中间载体,形成p YLcr RNA系列载体。采用Golden Gate或者Gibson Assembly组装方式可将扩增出的多个cr RNA表达盒一次性整合到包含Cpf1p表达盒的双元载体中。3.利用上述载体系统构建了3个Fn Cpf1p/cr RNA和3个Lb Cpf1p/cr RNA双靶点基因编辑载体,对水稻4个抗病负调控基因Os Pi21、Os ELF3-2、Os Pti1a和Os GA20ox3进行敲除,共获得121株阳性植株。对各个载体的打靶效率以及编辑特征进行了统计分析,其中68个Fn Cpf1p/cr RNA系统敲除的靶位点平均突变率为18.5%,53个Lb Cpf1p/cr RNA系统敲除的靶位点平均突变率为20.4%,它们的剪切点主要发生于PAM位点远端15-23 bp处,以缺失4-8 bp碱基为主。同时构建了2个Fn Cpf1p 6靶点基因编辑载体,发现单个启动子可诱导多个串联cr RNA进行多靶点基因敲除。4.利用重叠PCR技术,拼装了x Cas9p,并将其与p Ubi启动子连接,整合到包含真核筛选标记的双元载体上,形成p YLCRISPR/x Cas9p系列载体。5.优化了sg RNA（single-guide RNA）的结构,命名为sg RNAm（single-guide RNA modification）,形成p YLsg RNAm系列载体。采用Golden Gate或者Gibson Assembly组装方式将扩增出的多个sg RNAm表达盒一次性整合到包含x Cas9表达盒的双元载体中。6.构建了3个x Cas9p/sg RNAm双靶点载体以及构建了1个Cas9p/sg RNA双靶点载体和1个Cas9p/sg RNAm双靶点载体作为对照,对Os HDT701、Os ELF3-2、Os Bsr-k1等3个水稻抗病负调控基因进行敲除,共获得122株阳性植株。结果显示sg RNAm可有效提高基因编辑效率,x Cas9p系统识别PAM为NGG时,其编辑效率与Cas9p系统相当;但识别PAM为NGA时,其效率仅为7.1%,而识别PAM为NGT和NGC时,则表现为无编辑效率。7.利用上述基因编辑系统获得若干个水稻品种空育131（KY131）的Os Pi21-KO和Os HDT701-KO株系,在转基因T1代分离到不携带T-DNA（T-DNA free）株系,突变位点在后代可稳定遗传,分析了9个潜在脱靶切割位点,均未发现脱靶事件。8.分别对3个T-DNA free的Os Pi21-KO和Os HDT701-KO株系进行抗病性检测和主要农艺性状调查,结果显示:Os Pi21-KO株系比野生型KY131表现出更强的稻瘟病抗性;Os HDT701-KO株系对稻瘟病和白叶枯病均有较强的抗性。Os Pi21-KO株系的主要农艺性状与野生型KY131相比没有显著改变,而Os HDT701-KO株系的分蘖数和结实率则有所下降。本研究开发了植物Cpf1p和x Cas9p基因编辑系统,有效扩大了植物Cas9p系统的靶点选择范围,并成功创制了一批抗病水稻材料,为运用基因编辑改良作物提供了新的技术手段。