猪δ冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是近几年新发现的一种猪肠道冠状病毒,主要引起仔猪呕吐、腹泻及脱水等症状。2012年在香港猪群中首次检测到该病毒,2014年初在美国多个州的猪场中暴发PDCoV,随后在多个国家和地区猪群中都检测到了 PDCoV。PDCoV在我国猪群中的阳性检出率高达20%,特别是在腹泻仔猪粪便样品中其阳性检出率高达60%,给我国养猪行业带来了巨大的经济损失。目前,尚无有效的疫苗和商业化检测试剂盒来防控PDCoV,迫切需要开发出快速、准确、高效的诊断试剂盒。本研究利用实验室制备的PDCoVN蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体,建立了双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒,并对其进行了临床应用评估。具体试验内容如下:1.PDCoV N蛋白双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立为了获得高纯度的PDCoV N蛋白单克隆抗体和多克隆抗体,利用辛酸-硫酸铵沉淀法对制备的两株PDCoV N蛋白抗体进行纯化,利用间接ELISA和Western Blot方法对制备的抗体进行鉴定,结果显示获得两株高纯度的PDCoV N蛋白的抗体（一株单克隆抗体和一株多克隆抗体）,采用间接ELISA方法测定制备的抗体效价分别为1.28×105和6.4×104。随后利用过碘酸钠法对纯化的PDCoV N多克隆抗体进行辣根过氧化物（HRP）标记,为后续研制双抗体夹心ELISA试剂盒提供基础。以纯化的蛋白PDCoVN单克隆抗体为包被抗体,HRP标记的PDCoVN蛋白多克隆抗体为检测抗体,建立一种PDCoV双抗体夹心ELISA抗原检测的方法。利用常规的双抗体夹心ELISA抗原检测方法对各反应条件进行优化,如PDCoV N单克隆抗体的包被浓度、封闭液的选择及浓度、抗原孵育时间、检测抗体的最佳浓度及孵育时间等进行优化,初步建立了 PDCoV双抗体夹心ELISA抗原检测方法。其最佳反应条件为:PDCoVN蛋白单克隆抗体的包被浓度为100 ng/孔,最佳包被条件为4℃过夜,封闭条件为1%的BSA 37℃封闭2 h,抗原孵育时间为45min-60min,HRP标记的多克隆抗体最适工作浓度为1:8000,酶标抗体孵育时间为45min,TMB显色液显色时间为10 min。应用所建立的双抗体夹心ELISA抗原检测方法对50份PDCoV阴性的猪临床病料（粪便、肠道组织、小肠内容物）进行测定,以测定样品的平均值加上3倍的标准差（X+3SD）为该方法检测的临界值,最终确定该方法检测的临界值为OD450=0.196。应用所建立的方法对猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪萨佩罗病毒（PSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和猪呼肠孤病毒（MLRV）等猪常见病毒进行检测,结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。批内重复试验与批间重复试验的变异系数均小于7%,说明该方法具有良好的重复性。本部分试验建立的双抗体夹心ELISA抗原检测方法为下一步组装双抗体夹心ELISA试剂盒奠定了基础。2.PDCoV抗原检测试剂盒的组装及评估为了将建立的PDCoV双抗体夹心ELISA抗原检测方法组装成方便使用的商品化检测试剂盒,对所需试剂及材料进行制备、优化以及成品试剂盒的组装,并对试剂盒性能进行评估。利用组装的试剂盒对不同抗原进行检测,结果显示该试剂盒仅对PDCoV发生反应,而对PEDV、TGEV、PSV、PRV、PPV和MLRV均无反应,说明该试剂盒特异性良好:将PDCoV细胞毒（TCID50为1 06/0.1mL）进行10倍倍比稀释后,用组装的试剂盒对其进行检测,结果显示当病毒液稀释至10-4时,其检测结果仍为阳性,表明该组装试剂盒对PDCoV的检测线为100 TCID50;再利用不同批次及相同批次组装的试剂盒进行检测,其变异系数不大于8%,说明该试剂盒性能稳定,重复性良好。利用研制的试剂盒与实验室已建立的PDCoV普通PCR方法对20份仔猪病料（PDCoV阴、阳性病料各10份）进行平行检测,结果显示该试剂盒与普通PCR检测结果—致,均检出10份阳性样品,进一步利用研制的试剂盒与实验室已建立的PDCoV RT-PCR方法对临床送检的246份猪腹泻病料进行抗原检测,分析该试剂盒的符合率,结果显示该试剂盒的阳性符合率为89%,阴性符合率为96%,总符合率为97.15%。本部分试验成功将建立的双抗体ELISA抗原检测方法组装成检测试剂盒,为临床猪群中PDCoV感染的流行病学调查提供了的技术支持和检测试剂盒。3.PDCoV抗原检测试剂盒的初步应用为进一步了解所组装的试剂盒对临床病料检测的适用性,用已知病毒含量的病毒液与PDCoV阴性的猪粪便样品进行混合,然后用PDCoV双抗体夹心ELISA抗原检测方法进行检测,用PDCoV病毒含量为横坐标,ELISA测得的OD450值为纵坐标,绘制PDCoV病毒含量的标准曲线,其回归方程为y=-19.653+44.38*X,该标准曲线可用于临床猪腹泻类样品中PDCoV的定量检测。同时,将PDCoV感染猪睾丸（ST）细胞,于感染不同时间点收集细胞上清液,用该试剂盒对其进行检测,然后以PDCoV感染时间为横坐标,OD450值为纵坐标,绘制PDCoV在ST细胞上的一步生长曲线,结果显示该方法绘制的PDCoV在ST细胞上一步生长曲线与用TCID50值绘制的一步生长曲线趋势一致,说明该试剂盒可用于实验室对PDCoV的增殖特性等方面的研究。由于PDCoV具有广泛的组织嗜性,因此我们进一步利用研制的试剂盒对PDCoV感染仔猪的组织分布及病毒载量进行检测分析,结果显示,在感染PDCoV的组织样品中,脾脏、肾脏、回肠和直肠等组织中病毒含量较高,这也和我们前期应用荧光定量PCR方法检测的结果一致,表明该试剂盒适用于不同组织样品中PDCoV的检测。最后利用研制的试剂盒对临床收集的186份猪腹泻病料进行抗原检测,其中PDCoV 阳性的病料31份,其阳性检出率为17%,这为了解PDCoV在猪群中的流行情况提供了重要信息。综上所述,本研究成功研制出检测PDCoV抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒,该试剂盒具有较高的特异性和灵敏度,检测性能稳定,不仅可以应用于临床样品检测,同时还可用于实验室研究,为临床PDCoV诊断和流行病学调查提供技术支撑。