糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病最严重的并发症之一,其主要临床特点为:尿蛋白排泄率逐渐增加,肾功能减退直至终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)的发生。既往研究认为,DN的主要病理学特征为肾小球系膜细胞增殖,细胞外基质堆积,系膜增厚及肾间质纤维化,但这些因素只能解释30%-50%的尿蛋白排泄率和肾小球滤过率的变化。近年来,肾小球滤过屏障(Glomerular filtration barrier,GFB)结构和功能的改变,尤其是作为GFB重要组成部分的足细胞在DN发生和发展过程中的作用逐渐成为研究的热点。研究表明,足细胞是肾小球中分化程度最高的细胞,其自身修复能力有限,其损伤与蛋白尿的发生发展密切相关。大量研究表明,高糖环境下损伤的线粒体过度释放活性氧(Reactive oxygen species,ROS)所致的氧化应激,是糖尿病肾病足细胞损伤的共同基础,氧化应激可以通过多种方式导致足细胞损伤。研究发现,氧化应激可以通过影响足细胞功能蛋白如Nephrin、Podocalyxin和Desmin的表达,导致足细胞功能障碍和从基底膜脱落。Nephrin为足细胞裂孔隔膜的主要成分,在糖尿病肾病患者中其表达明显下降,且下降程度与蛋白尿的进展呈正相关。Podocalyxin是足细胞表面带负电荷的跨膜蛋白,是组成肾小球电荷屏障的基础。Desmin是一种中间丝蛋白,在正常足细胞中极少表达,但在损伤的足细胞中大量表达,是足细胞损伤的标志蛋白。氧化应激还可以通过线粒体凋亡通路介导足细胞凋亡,在糖尿病高血糖状态下,氧化应激导致线粒体损伤,线粒体外膜通透性增加,膜电位去极化,导致线粒体膜转运孔开放,细胞色素C(Cyto-C)释放到胞质中,导致Caspase的瀑布效应,最后激活caspase-3,诱导足细胞凋亡。因此,足细胞内损伤的线粒体需要被及时有效的清除,而细胞清除损伤或衰老线粒体的主要途径即线粒体自噬(Mitophagy)。线粒体自噬指细胞通过自噬的方式“选择性地”清除损伤线粒体的过程,从而维持细胞内线粒体质量和数量的平衡,在改善细胞氧化应激中发挥重要作用。线粒体自噬的选择性启动与PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)密切相关。PINK1是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,位于Parkin(E3泛素连接酶)的上游发挥作用。损伤的线粒体其膜电位发生去极化改变,从而引起PINK1蛋白在损伤线粒体外膜上的积聚,进而吸引Parkin聚集到损伤的线粒体上。Parkin可导致线粒体外膜蛋白泛素化,募集其它自噬相关蛋白如LC3等向线粒体转位,介导线粒体自噬的发生。综上所述,受损线粒体过度释放ROS所致的氧化应激,是糖尿病足细胞损伤的中心环节。线粒体自噬是一种有选择性的自噬,是特异清除损伤线粒体的过程。因此推测,线粒体自噬在改善糖尿病状态下足细胞氧化应激损伤具有重要意义。然而目前,有关糖尿病状态下足细胞内线粒体自噬功能状态,以及线粒体自噬与足细胞氧化应激关系的研究尚未见报道。因此,本课题开展以下研究:第一部分高糖培养的足细胞和糖尿病小鼠肾皮质中线粒体自噬功能状态的研究目的观察高糖培养的足细胞和糖尿病小鼠肾皮质中线粒体自噬的功能状态,初步探讨PINK1介导的线粒体自噬与足细胞氧化应激损伤关系。方法1.以正常糖浓度(5.6 mmol/L)培养分化后足细胞为正常对照组(NG),高糖组(HG)用糖浓度25 mmol/L的培养基培养。分别于24小时,48小时和72小时,用Mito SOX结合流式细胞仪检测线粒体ROS(mt ROS);透射电镜检测线粒体超微结构,损伤线粒体百分比及被自噬体包裹的线粒体百分比;罗丹明123结合流式细胞仪检测线粒体膜电位(MTP);荧光定量PCR分别检测PINK1,LC3和Parkin m RNA表达;Westernblot分别检测线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3Ⅱ,以及足细胞功能蛋白Nephrin、Podocalyxin和Desmin蛋白表达;Annexin V-FITCPI结合流式细胞仪检测各组细胞凋亡。6周龄SPF级健康雄性KM小鼠36只,体重为(26±2)g,在IVC系统中喂养1W以适应环境,自由供给食物和水,25度恒温恒湿,每12小时开关灯模拟昼夜环境。实验随机选取9只为NG组,29只构建DM小鼠小鼠模型。具体方法为:于实验前一天晚上停止喂食,12小时后按60 mg/kg在小鼠腹腔一次性注射1%STZ溶液,72h后断尾采血监测血糖并重复3次,以血糖≥16.7 mmol/L为1型糖尿病成模标准,NG组给予腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液。所有小鼠于造模成功后的4W、8W和12W末,麻醉收集标本后处死。用透射电镜检测线粒体超微结构,损伤线粒体百分比和被自噬体包裹的线粒体百分比;丙二醛(MDA)试剂盒检测MDA;荧光定量PCR分别检测PINK1,LC3和Parkin m RNA表达;Westernblot分别检测线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3Ⅱ,以及足细胞功能蛋白Nephrin、Podocalyxin和Desmin的蛋白表达;PAS染色检测肾小球糖原堆积;TUNEL染色检测凋亡;透射电镜检测足细胞超微结构。结果1.与NG组相比,高糖刺激后线粒体形态发生显著改变。NG组线粒体形态正常,呈杆状或椭圆形,线粒体外膜(OMM)光滑完整,脊形态完整,线粒体内膜(IMM)内电子密度均匀。高糖刺激后,随着时间的延长线粒体形态出现异常且逐渐加重,从轻度肿胀,外膜增厚到空泡样变,脊断裂或消失,外膜破裂。(图1.1 C)与NG组相比,高糖刺激24 h、48 h和72 h后,足细胞线粒体膜电位(MTP)显著下降(P<0.05),且下降程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.1 D,E)与NG组相比,高糖刺激24 h、48 h和72 h后,足细胞内损伤线粒体百分比明显增加(P<0.05),且增加程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.1 F)与NG组相比,高糖刺激24 h时被自噬体包裹的线粒体百分比略有下降,但下降程度无统计学意义(P>0.05),48h和72h时被自噬体包裹的线粒体百分比下降(P<0.05),且增加程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.1 G)与NG组相比,高糖刺激24 h、48 h和72 h后,足细胞线粒体ROS(mt ROS)显著增加(P<0.05),且增加程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.1 A,B)。2.与NG组相比,高糖刺激24 h后,PINK1 m RNA表达略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05);高糖刺激48h和72h后,PINK1 m RNA表达降低(P<0.05),且下降程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.2 A)与NG组相比,高糖刺激24h、48h、72h后,LC3和Parkin m RNA表达无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)。(图1.2 B,C)与NG组相比,高糖刺激24h后,PINK1蛋白表达略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05);高糖刺激48h和72h后,PINK1蛋白表达降低(P<0.05),且下降程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.2 D,F)与NG组相比,高糖刺激24h后,LC3Ⅱ蛋白表达略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05);高糖刺激48h和72h后,LC3Ⅱ蛋白表达降低(P<0.05),且下降程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.2 D,G)与NG组相比,高糖刺激24h后,Mito-Parkin蛋白表达略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05);高糖刺激48h和72h后,Mito-Parkin蛋白表达降低(P<0.05),且下降程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.2 E,H)与NG组相比,高糖刺激24h后,Cyto-Parkin蛋白表达略有升高,但差异无统计学意义(P>0.05);高糖刺激48h和72h后,Cyto-Parkin蛋白表达升高(P<0.05),且升高程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.2 E,I)3.与NG组相比,高糖刺激24h、48h、72h后,Nephrin和Podocalyxin蛋白表达显著下降(P<0.05),且下降程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.3 A,B,C)。与NG组相比,高糖刺激24h、48h、72h后,Desmin蛋白表达显著增加(P<0.05),且增加程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.3 A,D)。与NG组相比,高糖刺激24h、48h、72h后,足细胞凋亡比例显著增加(P<0.05),且增加程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.3 E,F)。4.与NG组相比,糖尿病组小鼠足细胞内线粒体形态学发生显著改变。NG组线粒体形态正常,呈杆状或椭圆形,线粒体外膜(OMM)光滑完整,脊形态完整,线粒体内膜(IMM)内电子密度均匀。糖尿病组小鼠,随着时间的延长线粒体出现形态异常且逐渐加重,从轻度肿胀,外膜增厚到空泡样变,脊断裂或消失,外膜破裂。(图1.4 A)与NG组相比,DM 4w,8w和12w组小鼠足细胞内损伤线粒体百分比明显增加(P<0.05),且增加程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.4 B)与NG组相比,DM 4w组小鼠足细胞内被自噬体包裹的线粒体百分比略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05),DM 8w和12w组小鼠足细胞内被自噬体包裹的线粒体百分比下降(P<0.05),且增加程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.4 C)与NG组相比,DM 4w,8w和12w组小鼠肾皮质MDA含量显著增加(P<0.05),且增加程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.4 D)5.与NG组相比,DM 4w组小鼠PINK1 m RNA表达略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05);8w和12w组小鼠PINK1 m RNA表达降低(P<0.05),且下降程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.5 A)与NG组相比,DM 4w、8w和12w组小鼠LC3和Parkin m RNA表达无显著变化,差异无统计学意义。(图1.5 B,C)与NG组相比,DM 4w组小鼠PINK1蛋白表达略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05);8w和12w组小鼠PINK1蛋白表达降低(P<0.05),且下降程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.5 D,F)与NG组相比,DM 4w组小鼠LC3Ⅱ蛋白表达略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05);8w和12w组小鼠LC3Ⅱ蛋白表达降低(P<0.05),且下降程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.5 D,G)与NG组相比,DM 4w组小鼠Mito-Parkin蛋白表达略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05);8w和12w组小鼠Mito-Parkin蛋白表达降低(P<0.05),且下降程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.5 E,H)与NG组相比,DM 4w组小鼠Cyto-Parkin蛋白表达略有升高,但差异无统计学意义(P>0.05);8w和12w组小鼠Cyto-Parkin蛋白表达升高(P<0.05),且升高程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.5 E,I)6.与NG组相比,DM 4w、8w和12w组小鼠Nephrin和Podocalyxin蛋白表达显著下降(P<0.05),且下降程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.6 A,B,C)与NG组相比,DM 4w、8w和12w组小鼠Desmin蛋白表达显著升高(P<0.05),且升高程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.6 A,D)与NG组相比,肾小球PAS染色发现DM 4w、8w和12w组小鼠肾小球体积明显增大,肾小球内细胞外基质逐渐增多,基底膜逐渐增厚;TUNEL染色发现DM 4w、8w和12w组小鼠足细胞凋亡比例显著增加(P<0.05),且增加程度呈时间依赖性(P<0.05)。(图1.6 E)与NG组相比,DM 4w、8w和12w组透射电镜显示,随着病程的延长足细胞密度越来越低,足突增宽逐渐加重,甚至融合消失。(图1.6 F)结论1.无论是在高糖培养的足细胞还是在糖尿病小鼠肾皮质中,损伤的线粒体增多,mt ROS释放增加,导致足细胞氧化应激损伤加重。2.高糖培养的足细胞和糖尿病小鼠肾皮质中,PINK1介导的线粒体自噬水平下降,对损伤线粒体清除能力不足。第二部分PINK1介导的线粒体自噬在高糖培养的足细胞氧化应激损伤中的作用及机制目的在细胞学水平,探讨PINK1介导的线粒体自噬在高糖培养的足细胞氧化应激损伤中的作用及机制。方法构建PINK1过表达慢病毒表达载体(LV-PINK1)和PINK1短发夹RNA(sh RNA)慢病毒表达载体(LV-sh-PINK1)及空慢病毒载体(LV-NC)。转染正常糖浓度(5.6 mmol/L)培养小鼠足细胞,按不同培养环境和处理分为:正糖对照组(NG),高糖组(HG,25 mmol/L),高糖PINK1上调组(HG+LV-PINK1),高糖PINK1下调组(HG+LV-PINK1),以及高糖空载体对照组(HG+LV-NC)。各组处理72h后,Mito SOX结合流式细胞仪检测线粒体ROS(mt ROS);透射电镜检测线粒体超微结构,损伤线粒体百分比和被自噬体包裹的线粒体百分比;罗丹明123结合流式细胞仪检测线粒体膜电位(MTP);荧光定量PCR分别检测PINK1,LC3和Parkin m RNA表达;Westernblot分别检测线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3Ⅱ,以及足细胞功能蛋白Nephrin、Podocalyxin和Desmin的蛋白表达;免疫荧光检测PINK1,LC3表达和细胞内定位;Annexin V-FITCPI结合流式细胞仪检测各组细胞凋亡。结果1.与NG组相比,HG组线粒体膜电位(MTP)显著下降(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组MTP进一步下降(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组MTP显著升高(P<0.05),但仍略低于NG组(P<0.05)。(图2.1)2.与NG组相比,HG组线粒体活性氧(mt ROS)生成显著增加(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组mt ROS进一步增高(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组mt ROS显著下降(P<0.05),但仍略高于NG组(P<0.05)。(图2.2)3.电镜下NG组线粒体形态正常,呈杆状或椭圆形,线粒体外膜(OMM)光滑完整,脊形态完整,线粒体内膜(IMM)内电子密度均匀。HG组和HG+LV-sh-PINK1组足细胞内线粒体肿胀变圆,外膜增厚空泡样变,脊断裂或消失,外膜不完整。HG+LV-PINK1组被自噬体包裹的线粒体即“线粒体自噬体”明显增多,其余线粒体形态正常,未见肿胀,脊断裂等,外膜完整光滑。(图2.3 A)与NG组相比,HG组足细胞内损伤线粒体百分比明显增加(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组损伤线粒体百分比进一步增高(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组损伤线粒体百分比显著下降(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图2.3 B)与NG组相比,HG组足细胞内被自噬体包裹的线粒体比例明显减少(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组被自噬体包裹的线粒体比例进一步减少(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组被自噬体包裹的线粒体比例显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图2.3 C)4.与NG组相比,HG组足细胞内PINK1 m RNA表达下降(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组PINK1 m RNA表达显著下降(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组PINK1 m RNA表达显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图2.4 A)各组之间足细胞内Parkin m RNA表达无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)。(图2.4 B)各组之间足细胞内LC3 m RNA表达无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)。(图2.4 C)5.与NG组相比,HG组足细胞内PINK1蛋白表达下降(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组PINK1蛋白表达显著下降(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组PINK1蛋白表达显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图2.5 A,B)与NG组相比,HG组足细胞内LC3Ⅱ蛋白表达下降(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组LC3Ⅱ蛋白表达显著下降(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组LC3Ⅱ蛋白表达显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图2.5 A,C)与NG组相比,HG组足细胞内线粒体上Parkin(Mito-Parkin)蛋白表达下降(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组Mito-Parkin蛋白表达显著下降(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组Mito-Parkin蛋白表达显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图2.5 D,E)与NG组相比,HG组足细胞内细胞质中Parkin(Cyto-Parkin)蛋白表达升高(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组Cyto-Parkin蛋白表达显著升高(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组Cyto-Parkin蛋白表达显著降低(P<0.05),且低于NG组(P<0.05)。(图2.5 D,F)与NG组相比,HG组足细胞内PINK1表达减少(P<0.05),且定位于线粒体的PINK1也减少(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组PINK1表达显著降低(P<0.05),且定位于线粒体的PINK1显著减少(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组线粒体表达显著升高(P<0.05),定位于线粒体的PINK1也显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图2.5 G)与NG组相比,HG组足细胞内LC3表达无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05),但定位于线粒体的LC3有所降低(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组LC3表达无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05),但定位于线粒体的LC3显著减少(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组LC3表达无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05),但定位于线粒体的LC3显著增多(P<0.05),且多于NG组(P<0.05)。(图2.5 H)6.与NG组相比,HG组足细胞细胞质内Cyto-C显著增加(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组细胞质内Cyto-C显著增加(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组细胞质内Cyto-C显著减少(P<0.05),且少于NG组(P<0.05)。(图2.6 A)与NG组相比,HG组足细胞内Caspase 3活性显著增加(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组Caspase 3活性显著增加(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组Caspase 3活性显著减少(P<0.05),且少于NG组(P<0.05)。(图2.6 B)与NG组相比,HG组足细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组足细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组足细胞凋亡率显著降低(P<0.05),且低于NG组(P<0.05)。(图2.6 C,D)与NG组相比,HG组足细胞内Nephrin、Podocalyxin蛋白表达显著降低(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组Nephrin、Podocalyxin蛋白表达显著降低(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组Nephrin、Podocalyxin蛋白表达显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图2.6 E,F,H)与NG组相比,HG组足细胞内Desmin蛋白表达显著增加(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-sh-PINK1组Desmin蛋白表达显著增加(P<0.05)。与HG组相比,HG+LV-PINK1组Desmin蛋白表达显著降低(P<0.05),且低于NG组(P<0.05)。(图2.6 E,G)结论1.高糖状态下,足细胞内氧化应激损伤与PINK1介导线粒体自噬水平下降呈负相关。2.上调高糖状态下PINK1介导的线粒体自噬,可显著改善足细胞氧化应激损伤,其机制为通过对损伤线粒体的清除,减少mt ROS的生成,从而减轻足细胞功能蛋白表达障碍和线粒体凋亡通路的激活。第三部分PINK1介导的线粒体自噬在糖尿病小鼠足细胞氧化应激损伤中的保护作用目的体内验证PINK1介导的线粒体自噬在糖尿病小鼠足细胞氧化应激损伤中的保护作用方法6W龄雄性健康SPF级KM小鼠40只,在IVC系统中喂养1W以适应环境,自由供给食物和水,25度恒温恒湿,每12小时开关灯模拟昼夜环境。STZ一次性腹腔注射构建1型DM小鼠模型。造模成功后,将小鼠随机分为3组:糖尿病组(DM组),糖尿病PINK1过表达慢病毒组(DM+LV-PINK1),以及糖尿病慢病毒空载体组(DM+LV-NC),并以同期正常小鼠为正常对照组(NG)。小鼠麻醉后,在解剖显微镜下右侧肾皮质上,中,下三极,点注射PINK1过表达慢病毒和空慢病毒载体10ul。病毒注射12W后,麻醉收集标本后处死小鼠,用透射电镜检测线粒体超微结构,损伤线粒体百分比和被自噬体包裹的线粒体百分比;丙二醛(MDA)试剂盒检测MDA;荧光定量PCR分别检测PINK1,LC3和Parkin m RNA表达;Westernblot分别检测线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3Ⅱ,以及足细胞功能蛋白Nephrin、Podocalyxin和Desmin的蛋白表达;PAS染色检测肾小球糖原堆积;TUNEL染色检测凋亡;透射电镜检测足细胞超微结构。结果1.电镜下NG组小鼠足细胞内线粒体形态正常,呈杆状或椭圆形,线粒体外膜(OMM)光滑完整,脊形态完整,线粒体内膜(IMM)内电子密度均匀。DM组小鼠足细胞内线粒体肿胀变圆,外膜增厚空泡样变,脊断裂或消失,外膜不完整。DM+LV-PINK1组小鼠足细胞内被自噬体包裹的线粒体即“线粒体自噬体”明显增多,其余线粒体形态正常,未见肿胀,脊断裂等,外膜完整光滑。(图3.1 A)与NG组相比,DM组小鼠足细胞内损伤线粒体百分比明显增加(P<0.05)。与DM组相比,DM+LV-PINK1组损伤线粒体百分比显著下降(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图3.1 B)与NG组相比,DM组足细胞内线粒体自噬体比例明显减少(P<0.05)。与DM组相比,DM+LV-PINK1组线粒体自噬体显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图3.1 C)与NG组相比,DM组小鼠肾皮质内MDA明显增加(P<0.05)。与DM组相比,DM+LV-PINK1组肾皮质内MDA显著下降(P<0.05),且低于NG组(P<0.05)。(图3.1 D)2.与NG组相比,DM组肾皮质内PINK1 m RNA表达下降(P<0.05)。与DM组相比,DM+LV-PINK1组PINK1 m RNA表达显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图3.2 A)各组之间肾皮质内Parkin m RNA表达无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)。(图3.2 B)各组之间LC3 m RNA表达无显著区别,差异无统计学意义(P>0.05)。(图3.2 C)3.与NG组相比,DM组肾皮质内PINK1蛋白表达下降(P<0.05)。与DM组相比,DM+LV-PINK1组PINK1蛋白表达显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图3.3 A,B)与NG组相比,DM组肾皮质内LC3Ⅱ蛋白表达下降(P<0.05)。与DM组相比,DM+LV-PINK1组LC3Ⅱ蛋白表达显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图3.3 A,C)与DM组相比,DM组肾皮质内线粒体上Parkin(Mito-Parkin)蛋白表达下降(P<0.05)。与DM组相比,DM+LV-PINK1组Mito-Parkin蛋白表达显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图3.3 D,E)与NG组相比,DM组肾皮质内细胞质中Parkin(Cyto-Parkin)蛋白表达升高(P<0.05)。与DM组相比,DM+LV-PINK1组Cyto-Parkin蛋白表达显著降低(P<0.05),且低于NG组(P<0.05)。(图3.3 D,F)与NG组相比,DM组肾皮质内PINK1表达减少(P<0.05),且定位于线粒体的PINK1也减少(P<0.05)。与DM组相比,DM+LV-PINK1组线粒体表达显著升高(P<0.05),定位于线粒体的PINK1也显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图3.3 G)与NG组相比,DM组肾皮质内LC3表达无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05),但定位于线粒体的LC3有所降低(P<0.05)。与DM组相比,DM+LV-PINK1组LC3表达无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05),但定位于线粒体的LC3显著增多(P<0.05),且多于NG组(P<0.05)。(图3.3 H)4.Westernblot检测发现与NG组相比,DM组足细胞内Nephrin、Podocalyxin蛋白表达显著降低(P<0.05)。与DM组相比,DM+LV-PINK1组Nephrin、Podocalyxin蛋白表达显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图3.4 A,B,D)与NG组相比,DM组足细胞内Desmin蛋白表达显著增加(P<0.05)。与HG组相比,DM+LV-PINK1组Desmin蛋白表达显著降低(P<0.05),且低于NG组(P<0.05)。(图3.4 A,C)肾小球PAS染色发现,与NG组相比,DM组小鼠肾小球体积明显增大,肾小球内细胞外基质增多,基底膜增厚;与DM相比,DM+LV-PINK1组上述情况有显著改善。(图3.4 E)TUNEL染色发现,与NG组相比,DM组小鼠足细胞凋亡比例显著增加(P<0.05);与DM相比,DM+LV-PINK1组小鼠足细胞凋亡比例显著下降(P<0.05),但仍略高于NG组(P<0.05)。(图3.4 E)肾小球免疫组化显示,与NG组相比,DM组足细胞内Nephrin、Podocalyxin蛋白表达显著降低(P<0.05)。与DM组相比,DM+LV-PINK1组Nephrin、Podocalyxin蛋白表达显著升高(P<0.05),且高于NG组(P<0.05)。(图3.4 F)与NG组相比,DM组足细胞内Desmin蛋白表达显著增加(P<0.05)。与HG组相比,DM+LV-PINK1组Desmin蛋白表达显著降低(P<0.05),且低于NG组(P<0.05)。(图3.4 F)透射电镜显示,与NG组相比,DM组小鼠肾小球足细胞密度降低,足突增宽,融合消失。与DM相比,DM+LV-PINK1组上述情况有显著改善。(图3.4 G)5.与NG组小鼠相比,DM组小鼠体重(BW)显著下降(P<0.05)。与DM组小鼠相比,DM+LV-PINK1组体重显著增加(P<0.05),但仍低于NG组(P<0.05)。(表3.1)与NG组小鼠相比,DM组和DM+LV-PINK1组小鼠血糖(BG)显著升高(P<0.05),DM组和DM+LV-PINK1组两组间血糖无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)。(表3.1)与NG组小鼠相比,DM组小鼠组BG、UPro/24h、UAIb、Scr、BUN显著升高(P<0.05)。与DM组小鼠相比,DM+LV-PINK1组BG、UPro/24h、UAIb、Scr、BUN显著下降(P<0.05),但仍略高于NG组(P<0.05)。(表3.1)结论1.上调糖尿病小鼠肾皮质内PINK1介导的线粒体自噬水平,可显著改善足细胞氧化应激损伤。