巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌分别是引起猪巴氏杆菌病、猪链球菌病、猪支原体肺炎、猪传染性胸膜肺炎和格拉瑟氏病的主要病原,也是当前养猪业常见的五种呼吸系统疾病病原菌。这五种病原菌均可引起猪的呼吸道疾病,且引起的临床症状和病理变化通过肉眼观察有时难以区分。有时还存在这几种病原菌混合感染的情况,更给疾病的诊断造成困难。为了有效鉴定这些病原菌,本课题拟建立一种同时鉴定这五种病原的PCR诊断方法。1.猪呼吸系统病原菌单重PCR检测方法的建立目的:建立猪呼吸系统病原菌的单重PCR检测方法。方法:针对巴氏杆菌plpE基因、猪链球菌gdh基因、猪肺炎支原体mhp677基因、胸膜肺炎放线杆菌apxⅣ基因和副猪嗜血杆菌vanY基因序列各设计1对引物,确定每种病原单重PCR的退火温度和敏感性,验证引物的特异性。结果:确定五种病原单重PCR扩增的退火温度范围为54℃-60℃,每对引物均为相应病原菌特异的引物。plpE基因的最低检出限为0.01 ng/μL,gdh基因的最低检出限为0.1 ng/μL,mhp677基因的最检出限为0.1 ng/μL,apxⅣ基因的最低检出限为0.1 ng/μL,vanY基因的最低检出限为1 ng/μL。结论:建立了五种病原各自的单重PCR检测方法,为五重PCR检测方法的建立奠定了基础。2.猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的建立目的:建立猪呼吸系统病原菌的五重PCR检测方法。方法:将确定的5种病原菌单重PCR检测方法的引物和模板混合,确定五重PCR反应的退火温度和和敏感性,验证引物的特异性。结果:五重PCR反应的退火温度为60℃,每对引物均为相应病原菌特异的引物。在五重反应PCR体系中,plpE基因的最低检出限为1 ng/μL,gdh基因的最低检出限为10 ng/μL,mhp677基因的最低检出限为1 ng/μL,apxⅣ基因的最低检出限为10 ng/μL,vanY基因的最低检出限为10ng/μL。结论:建立了猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法。3.猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法的应用目的:验证所建立的五重PCR方法是否可用于临床检测。方法:采集病变猪肺组织,提取基因组后用已经建立的方法检测五种巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌。结果:对采集的224份临床样本的检测结果表明,在65份样品中检测到上述五种病原中的至少一种,其中50份样品为单纯感染,15份为混合感染。结论:本研究所建立的猪呼吸系统病原菌五重PCR检测方法可用于猪呼吸系统病原菌巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的检测及病原流行病学调查。