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研究背景近年来,全球男性精子质量出现普遍下降现象,由此导致的男性生殖问题引起世界各国高度关注~[1]!据报道~[2],2015年中国不孕不育的发生率高达15%,其中男方问题占50%。已有数据显示~[3],上世纪80年代至本世纪初,中国成年男性精子密度、精子总数和精子正常形态率分别下降了23.84%、30.07%和14.15%,可见我国成年男性精子质量情况不容乐观。研究已证实,环境因素是导致男性精子质量下降的主要原因~[4,5]。随着科技的飞速发展,射频辐射(radiofrequency radiation,RFR)在各个领域的应用日益广泛,从而人们暴露于RFR中的时间、强度和复杂性明显增加。RFR已成为现代社会主要环境污染源之一~[5-10],其对男性精子质量的影响日益受到关注。既往研究表明~[11,12],睾丸是RFR的敏感靶器官之一,特定条件的RFR暴露对睾丸具有损伤效应,可直接或间接影响精子质量。但目前研究多集中在生活环境RFR对精子质量的影响,较少涉及职业环境RFR。因此,本课题探讨了职业环境RFR对精子质量的影响及其机制。本研究选择无线电通讯时常用的220兆赫兹(megahertz,MHz)RFR为暴露频率,以精子数量、精子畸形率和精子存活率为主要检测指标,探讨了220 MHz RFR对大鼠精子质量的影响,并从睾丸形态结构、睾丸间质细胞和支持细胞分泌功能及睾丸细胞凋亡等方面对其相关机制进行了探讨。研究目的明确220 MHz职业环境RFR暴露对大鼠精子质量的影响并初步阐明其作用机制,为职业环境RFR卫生标准的制定或修订提供理论和实验依据。第一部分220 MHz职业环境射频辐射对大鼠精子质量的影响材料与方法1.辐照源:RFR辐照系统,主要由信号发生器、放大器、耦合器、功率传感器和辐射天线组成,产生的信号为脉冲调制波,频率220 MHz,输出功率可调。2.动物分组及辐照:健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只(体质量237.1±8.1 g),随机分为两个不同暴露剂量组(50 W/m~2组和100 W/m~2组)及一个假暴露组(Sham组),每组20只大鼠。RFR具体暴露参数如下:1)50 W/m~2组:平均功率密度为50 W/m~2,大鼠全身平均比吸收率(specific absorption rate,SAR)为0.030W/kg,睾丸平均SAR为0.014 W/kg;2)100 W/m~2组:平均功率密度为100 W/m~2,大鼠全身平均SAR为0.061 W/kg,睾丸平均SAR为0.029 W/kg;3)Sham组:动物处理同射频暴露组,但射频控制系统输出功率为0。暴露前,将动物单只置于各壁带孔的有机玻璃盒内,头部朝向天线摆放动物,然后全身暴露或假暴露于220 MHz RFR,1 h/d,连续暴露30 d。3.实验方法:1)采用肛温计测量220 MHz RFR暴露1 h前后大鼠肛温的变化;2)暴露30 d过程中,每3 d记录大鼠体质量变化,绘制增长曲线并计算暴露前后各组大鼠体质量增加量,3)暴露30 d后次日取材,剥离双侧睾丸并记录重量,计算睾丸指数;4)剥离双侧附睾,游离精子,光镜下观察并统计精子数量、畸形率和存活率等指标。研究结果1.220 MHz职业环境射频辐射对大鼠肛温的影响大鼠肛温检测结果显示,220 MHz RFR全身暴露1 h,大鼠肛温暴露前后变化不超过1℃。两暴露组和Sham组大鼠相比,肛温未见明显差异(P>0.05)。提示该条件220 MHz RFR暴露未引起大鼠体温的明显变化。2.220 MHz职业环境射频辐射对大鼠一般健康状况的影响与Sham组相比,两暴露组大鼠在整个实验过程中其进食、饮水、毛发、胡须、精神状态和体质量无明显变化。220 MHz RFR连续暴露30 d后,两暴露组大鼠体质量增加量、双侧睾丸重量及睾丸指数与Sham组相比,均未见统计学差异(P>0.05)。上述结果提示,本实验条件下220 MHz RFR暴露对大鼠一般健康状况无明显影响。3.220 MHz职业环境射频辐射对大鼠精子质量的影响3.1精子数量检测结果显示:与Sham组相比,50 W/m~2组(P<0.05)和100 W/m~2组(P<0.01)大鼠精子数量明显减少,且暴露剂量越大,效应越明显。3.2精子畸形率检测结果显示:与Sham组相比,50 W/m~2组大鼠精子畸形率稍有增加,但未见统计学差异(P>0.05),100 W/m~2组大鼠精子畸形率明显增加(P<0.01)。3.3精子存活率检测结果显示:与Sham组相比,50 W/m~2组(P<0.05)和100W/m~2组(P<0.01)大鼠精子存活率均显著下降,且暴露剂量越大,效应越明显。第二部分220 MHz职业环境射频辐射致大鼠精子质量下降的机制研究材料与方法1.辐照源:同第一部分实验。2.动物分组及辐照:同第一部分实验。3.检测方法:1)采用苏木精和伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色观察大鼠睾丸的形态结构,十字交叉法测量大鼠睾丸生精小管直径;2)采用免疫组织化学染色观察大鼠睾丸中精原干细胞特异性标志物OCT4的表达;3)采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)检测大鼠血清中睾酮(testosterone,T)含量以及睾丸组织中支持细胞的分泌因子水平,后者包括胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)、转铁蛋白(transferrin,TRF)和雄激素结合蛋白(androgen binding protein,ABP);4)采用蛋白质免疫印迹(western blot,WB)法检测大鼠睾丸组织中GDNF、SCF,以及凋亡相关蛋白(Csapase 3、BAX和BCL 2)的表达水平;5)采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测睾丸组织中17β-HSD3、GDNF及其受体GFRa1、SCF及其受体C-kit及Caspase 3的mRNA表达水平;6)采用免疫荧光染色观察睾丸组织中Cleaved-Caspase 3蛋白的表达。研究结果1.220 MHz职业环境射频辐射对大鼠睾丸形态结构的影响HE染色结果显示,两暴露组大鼠的睾丸组织生精上皮基膜完整,生精小管内的各级生精细胞排列整齐、层次清楚、发育正常,管腔内可见成熟精子,间质细胞、支持细胞形态正常。与Sham组相比,两暴露组大鼠的睾丸形态结构和生精小管直径未见明显差异(P>0.05)。上述结果提示,本实验条件下220 MHz RFR暴露对大鼠睾丸光镜下形态结构无明显影响。2.220 MHz射频辐射对大鼠睾丸精原干细胞的影响免疫组化染色结果显示,两暴露组大鼠睾丸组织中OCT4蛋白表达水平与Sham组相比未见明显改变(P>0.05)。提示,本实验条件下220 MHz RFR暴露对精原干细胞无明显影响。3.220 MHz射频辐射对大鼠睾丸间质细胞分泌功能的影响ELISA检测结果显示,与Sham组相比,50 W/m~2组大鼠血清睾酮含量明显下降(P<0.05),100 W/m~2组大鼠血清睾酮含量显著升高(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,睾酮的合成限速酶17β-HSD3 mRNA的水平在50 W/m~2组未见明显变化(P>0.05),在100 W/m~2组明显升高(P<0.01)。上述结果提示,本实验条件下220 MHz RFR可影响睾丸间质细胞的合成和分泌功能。4.220 MHz射频辐射对大鼠睾丸支持细胞分泌功能的影响ELISA检测结果显示,两暴露组大鼠睾丸组织内GDNF、SCF、TRF和ABP含量与Sham组相比未见明显改变(P>0.05)。WB结果显示,两暴露组睾丸组织内GDNF和SCF蛋白的表达和Sham组相比未见明显改变(P>0.05)。qRT-PCR结果显示,两暴露组睾丸组织中GDNF及其受体GFRa1,SCF及其受体C kit的mRNA表达和Sham组相比均未见明显变化(P>0.05)。上述结果提示,本实验条件下220MHz RFR暴露对睾丸支持细胞的分泌功能无明显影响。5.220 MHz射频辐射对大鼠睾丸细胞凋亡的影响免疫荧光染色结果显示,Cleaved-Caspase 3染色阳性细胞多分布在生精小管内,与Sham组相比,Cleaved-Caspase 3蛋白表达在50 W/m~2组(P<0.05)和100 W/m~2组(P<0.01)均显著升高。WB检测结果显示,与Sham组相比,50 W/m~2组和100W/m~2组睾丸组织中总Caspase 3蛋白水平均显著升高(P<0.01)。与Sham组相比,两暴露组睾丸组织中BAX水平未见明显变化(P>0.05),BCL 2水平明显降低(P<0.01),BAX/BCL 2比值均显著升高(P<0.01),与Caspase 3蛋白水平结果一致。qRT-PCR结果显示,睾丸组织中Caspase 3 mRNA的表达在50 W/m~2组和100W/m~2组有升高趋势,但未见统计学差异。上述结果提示,本实验条件下220 MHz RFR可增加睾丸细胞凋亡,且暴露剂量越大,效应越明显。研究结论该实验条件下的220 MHz射频辐射暴露1.可降低大鼠的精子质量,且暴露剂量越大,效应越明显;2.可引起睾丸间质细胞合成和分泌睾酮功能的变化;3.可诱导睾丸细胞凋亡;4.精子质量下降可能与睾酮水平改变及睾丸细胞凋亡增加有关。