研究背景：甲状腺疾病时机体常伴有血脂异常,如甲状腺功能减退时常合并有高胆固醇血症,而甲状腺功能亢进时则常伴有血胆固醇水平降低。以往认为甲状腺功能减退患者血胆固醇水平升高的主要机制是：甲状腺激素(TH)水平降低,导致肝脏低密度脂蛋白受体(LDL-R)表达减少、活性降低,血浆低密度脂蛋白(LDL)清除减少,因而引起血浆中的总胆固醇(TC)水平升高。然而,临床上出现的一些特点往往无法用这种传统理论去解释。例如,亚临床甲状腺功能减退时,促甲状腺素(TSH)水平升高,TH水平正常,但血清TC水平升高。另外在继发性甲减时,TSH、TH均降低,TC也随之降低。从以上现象我们可以看到在甲状腺功能减退时血清TC的变化除与TH有关外,也与TSH有某种不曾被人们认识的关系。而近几年,不断出现的一些大型流调研究也发现在亚临床甲减时TSH与TC相关。例如,最近Turha报道在亚临床甲状腺功能减退时血清TSH与TC有明显相关性(r=0.52；p=0.001)。另一项研究发现亚临床甲减患者经过L-T4治疗后血清TSH水平下降至0.2-2mU／L,TC也明显下降。亦有报道在妇女中TSH每升高1mU／L则伴有0.09mmol／L血胆固醇的升高。而在老年人群中,当TSH>5.5mU／L时血胆固醇较正常时有0.23mmol／l(9mg/dl)的升高,进一步的计算得出TSH水平每升高1mU／L,就伴随有0.09mmol／l(3.5mg／dl)血浆胆固醇浓度的提高。这些临床现象均无法通过传统理论中关于TH对胆固醇代谢调节的理论得到完全解释。在这之前,有研究发现另外一个垂体激素.促性腺释放激素(FSH)对骨吸收和骨形成有直接的调节作用。这一研究结果表明垂体激素可能参与周围组织器官生理调节作用。因此我们有信心也有必要对TSH在胆固醇合成过程中的作用及机制进行研究。一般情况下内源性合成是机体胆固醇最主要的来源。其中肝脏是机体胆固醇合成最旺盛的器官。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A, HMG-CoA)还原酶(HMGCR)位于细胞内质网内,由它催化的由HMG-CoA还原成甲羟戊酸(Mevalonate, MVA)的反应是整个胆固醇合成途径中的限速反应,HMGCR则是合成反应的限速酶。通过调节该酶可维持体内胆固醇的稳定。现今,人们已公认肝脏在调节机体胆固醇代谢方面发挥中心作用。HMGCR也被发现存在于机体其它器官,但在肝脏却有更高水平的表达,在一些动物,肝脏具有最高的HMGCR活性和胆固醇生物合成能力。促甲状腺素受体(thyrotropin receptor, TSHR)是人体内介导TSH甲状腺调控功能的重要的蛋白分子。大量研究表明,TSHR不仅表达于甲状腺细胞表面,而且广泛表达于如脂肪细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、骨细胞及神经细胞等在内的非甲状腺组织细胞内,且在这些组织细胞内发挥重要的病理生理作用。肝脏作为机体内最重要的组织器官之一,在肝细胞表面是否亦有TSHR的表达,进而介导TSH起调控作用的作用呢?我们前期的研究已证明人体正常肝组织、体外培养的人正常肝细胞株L-02细胞以及正常Wistar与Sprague Dawley (SD)大鼠肝组织有TSHR的表达,并且TSH可剂量依赖性地增加L-02细胞内cAMP的含量,说明肝细胞表面表达有功能性的TSH受体。本研究拟通过体外和体内实验研究TSH对肝细胞HMGCR表达的影响及相关机制,以探讨TSH在胆固醇合成中可能存在的调节作用。研究目的：1.前期研究已证明肝细胞膜上表达功能性TSH受体(TSHR),本课题拟通过研究TSHR介导的TSH作用,上调肝细胞HMGCR表达,增加肝细胞内总胆固醇(TC)含量,引起高胆固醇血症,从而揭示TSH在胆固醇合成中的可能机理。2、通过TSH刺激肝细胞cAMP/PKA/CREB信号途径的实验研究,揭示TSH增加肝细胞HMGCR的表达的作用机制。研究方法：1、为了研究肝细胞表达功能性TSHR,实验用牛TSH、胰高血糖素或福斯考林刺激L-02、培养的人原代肝细胞和小鼠胚胎肝细胞系BNL细胞,检测cAMP释放。福斯考林作为阳性对照。2、在体外实验,用牛TSH处理肝细胞,检测细胞HMGCR表达。在刺激实验中,用无血清培养基培养人正常肝细胞系L-02、人原代肝细胞和BNL细胞,用不同浓度的TSH作用一定时间,检测TSH对HMGCR剂效性和时效性关系。3、为表明TSH影响肝细胞HMGCR的表达是通过TSHR作用的,实验用人单克隆抗体CS-17与TSH竞争结合TSHR。L-02细胞和人原代肝细胞用CS-17预培养60分钟,然后用TSH继续作用60分钟,检测cAMP释放。另外,我们采用慢病毒介导的RNA干扰病毒感染培养的肝细胞,敲除肝细胞TSHR表达,检测TSH刺激后cAMP的释放和HMGCR的表达的变化。4、为了探讨TSH诱导上调肝细胞HMGCR表达是通过cAMP信号系统,用腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536预孵肝细胞,再用TSH刺激肝细胞,检测cAMP和HMGCR变化。5、为了证实TSH刺激增加肝细胞HMGCR mRNA水平是通过增加HMGCR启动子的活性作用实现的,本研究设计相应HMGCR启动子的一个DNA片段,与荧光素酶基因融合,构建荧光素酶报告基因,然后转染到L-02细胞。在不同处理条件下,测定荧光素酶活性。实验选择福斯克林为阳性对照,用0.4和4μMTSH刺激L-02细胞8小时。6、通过ChIP实验定量分析TSH刺激L-02细胞激活HMGCR转录活性。将L-02细胞分为四组：福斯克林(0.5μM)组,TSH(4μM)组,H89(PKA阻断剂,20μM)组,RNA干扰组。7、为进一步明确TSH是否对CREB/DNA结合活性有影响,从L-02细胞提取核蛋白进行了EMSA实验研究。从未加处理的细胞,加了4μMTSH和20μMH89的细胞中提取等量的核蛋白,探针用生物素标记。8、为了进一步研究TSH增加肝细胞HMGCR表达,增加胆固醇水平,我们通过手术切除大鼠甲状腺建立了甲减大鼠模型。切除了大鼠甲状腺,就失去了对TSH的刺激反应,血中甲状腺素水平降低甚至消失,这样就可以通过注射外源性T4或TSH人为的控制大鼠体内TSH水平,达到实验目的。术后30天检测,血清TT4≤1.41ng/ml认为甲状腺已完全摘除,为实验组大鼠(48只),未达到要求的切除甲状腺大鼠排除实验外。同时设假手术组(30只)。研究结果：1、肝细胞膜表达具有功能活性的TSH受体与对照组比较,福斯考林显著增加L-02细胞内cAMP水平(约2.8倍,p<0.001),同样,bTSH刺激也明显增加了细胞内cAMP水平(约为福斯考林组的三分之二,p<0.05)。实验中以CHO细胞为阴性对照,因为在其细胞表面不存在TSH受体,本实验发现福斯考林显著增加CHO细胞内cAMP水平(p<0.05),但是bTSH刺激CHO细胞后细胞内cAMP水平无明显变化(p>0.05)。同样,我们用bTSH、福斯考林和胰高血糖素刺激原代培养的人肝细胞和BNL细胞均显著增加了细胞内cAMP水平。并且,与L-02细胞比较,人原代肝细胞对bTSH反应更明显(p<0.05)。表明新鲜分离的人肝细胞具有更好的肝细胞活性。2、TSH增加肝细胞HMG-CoA还原酶(HMGCR)的表达和活性(1)不同浓度bTSH对HMGCR蛋白的影响与对照组相比,0.1μM、1μM、4μM bTSH处理后L-02细胞内HMGCR蛋白均有明显增加,分别增加了30％、58％与110％,差异有统计学意义p<0.05或p<0.01)。说明bTSH可剂量依赖性地上调HMGCR蛋白水平。(2)不同浓度bTSH刺激对HMGCR mRNA水平的影响与正常对照组相比,bTSH刺激组HMGCR mRNA表达增强,2μM (p<0.05)与4μM (p<0.01)bTSH干预组与对照组相比分别提高了92％与150％,差异均有统计学意义,且4μM bTSH刺激作用强于0.2μM作用(p<0.01)。说明bTSH可剂量依赖性地上调HMGCR mRNA水平。(3)不同浓度bTSH对人原代肝细胞和小鼠肝细胞系HMGCR蛋白的影响：与L-02细胞相似,0.1μM、1μM、4μM bTSH刺激人原代肝细胞和NBL细胞48小时后,Wester blot示细胞内HMGCR蛋白水平均呈剂量依赖性增加。(4)不同浓度bTSH对HMGCR活性的影响：分别用0.1μM、1μM、4μM bTSH处理L-02细胞48h后发现,随bTSH剂量的增加L-02细胞HMGCR活性水平也呈增加趋势。与对照组比较,0.1μM bTSH和4μM bTSH增加HMGCR活性分别为2和4倍(p=0.013和p<0.001)。3、TSH刺激增加L-02细胞内总胆固醇(TC)含量随着bTSH浓度的增加,细胞内TC含量逐渐增加,与对照组比较,1μM和4μM bTSH刺激增加TC含量分别为2.2和3倍(p=0.032和p=0.004)。同时,刺激48h后TC含量明显高于24h(p<0.01)。TSH对肝细胞内TC水平影响的这种剂效和时效关系与对HMGCR刺激效应一致,表明TSH作用肝细胞后通过上调HMGCR表达,增加细胞内总胆固醇含量。4.TSH诱导肝细胞HMGCR表达依赖于TSHR(1)L-02细胞和人原代肝细胞在bTSH刺激下,细胞内cAMP水平分别增加了约2.8和3.5倍(p<0.001),在CS-17预处理后,bTSH刺激下细胞内cAMP水平均无明显增加(p>0.05)。表明CS-17抑制了bTSH诱导的细胞内cAMP水平的增加。同样,与对照组比较,TSH刺激可显著增加HMGCR蛋白表达,但是在CS-17处理L-02细胞后,TSH作用后细胞HMGCR蛋白表达无明显变化。表明CS-17抑制了bTSH诱导的肝细胞HMGCR蛋白的增加。(2)慢病毒介导的TSH受体RNA干扰：TSHR-RNAi-lentivirus显著降低TSH诱导的L-02细胞cAMP释放和HMGCR表达,以及TC含量的增加。(3)RNAi干扰TSHR基因表达后TSH对BNL CL.2细胞HMG-CoA还原酶含量的影响：siRNA干扰处理细胞HMG-CoA还原酶含量与正常对照组比较无明显变化,TSH明显提高未加siRNA干扰的细胞HMG-CoA还原酶含量,TSHR-siRNA干扰TSHR基因表达后,TSH不能引起细胞HMG-CoA还原酶含量的明显升高,而错配的non-targeting siRNA处理后TSH仍可明显增高细胞HMG-CoA还原酶含量,增高程度与未加siRNA干扰的正常细胞TSH处理后基本相同。5、TSH通过cAMP/PKA/CREB信号通路上调肝细胞HMGCR表达(1)用SQ22536预孵L-02细胞和人原代肝细胞1小时,继续TSH刺激细胞1小时。我们发现,无论是L-02细胞,还是人原代肝细胞,SQ22536均能显著降低TSH诱导的细胞内cAMP水平(P<0.01)。无SQ22536预处理的L-02细胞,在TSH刺激48小时后HMGCR蛋白表达明显增加,但是SQ22536处理后的细胞,在TSH刺激后,HMGCR蛋白表达无明显增加。(2)实验选择福斯克林为阳性对照,用0.4和4μM TSH刺激L-02细胞8小时。结果表明,福斯克林增加荧光素酶活性2.4倍,0.4和4μM TSH刺激L-02细胞增加荧光素酶活性分别为1.5和2.2倍。进而将HMGCR启动子上的CRE结合位点突变,突变序列为：TGACGTAG to TAAAAGGG。我们发现无论是TSH,还是福斯克林刺激均不能增加荧光素酶活性。这一实验表明TSH调控HMGCR基因转录是通过CRE结合位点实现的。(3)与对照组比较,福斯克林刺激L-02细胞显著增加磷酸化CREB(Ser133 pCREB)的结合能力(P<0.001),而TSH刺激L-02细胞增加pCREB结合能力约2.3倍(P<0.001)。H89可明显抑制TSH诱导的pCREB结合能力(P=0.019与对照组比较)。同样,RNA干扰也显著抑制TSH诱导的pCREB结合能力(P=0.002与TSH组比较)。(4) ESMA实验结果表明TSH可以增加CREB/DNA结合活性,在凝胶电泳图上可看到较强的CREB/DNA混合物条带。当加入H89后这个条带明显减弱,表明TSH增加CREB/DNA结合活性是通过PKA通路实现的。6、TSH增加甲状腺切除(Tx)鼠肝脏HMGCR表达,增加血清TC水平(1)Tx和(假手术)Sh组大鼠血清TT4分别为0.55±0.32(ng／ml)和7.60±2.15(ng／ml),血清TSH分别为41.9～6.20(uIU／mL)和0.63±0.23(uIU／mL)。T4和TSH的差异均具有统计学意义。Tx和Sh组大鼠血清总胆固醇水平分别为2.33±0.34mmol／l和1.46±0.0.32mmol／l,Tx大鼠血清胆固醇水平明显升高,差异具有统计学意义。Western blot分析HMGCR和LDLR蛋白表达。目的条带在90KD和160KD左右,以β-actin为参照。结果发现,与Sh组大鼠比较,Tx大鼠肝组织HMGCR蛋白明显升高(P<0.05),而LDLR明显降低(P<0.05)。(2)TSH对血浆TC水平的影响：将Tx大鼠分成4组,每组12只大鼠：①Tx；②Tx+T4；③Tx+T4+小剂量TSH；④Tx+T4+中剂量TSH；⑤Tx+T4+大剂量TSH。结果发现①组Tx大鼠TC水平较假手术组显著升高,当给予恒定量T4后,血浆中T4水平升高,而TSH水平下降,与假手术组大鼠相当,也就是说T4处理后恢复了甲减大鼠血浆T4和TSH水平。同样,TC水平也明显下降。当血中T4值达到恒定水平后,给外源性TSH注射,我们发现,与未注射TSH组的大鼠(即②)比较,注射TSH组大鼠(即③④⑤组)血浆TC水平剂量依赖性升高,但差异无统计学意义。进一步分析发现,在同一只大鼠,注射TSH前后血清胆固醇水平有变化,注射TSH后TC水平较注射前升高,且有统计学意义。(3)TSH对肝组织HMGCR和LDLR表达的影响：同时,上述前4组大鼠肝组织做HMGCR和LDLR检测,结果显示,与Tx大鼠比较,注射T4后HMGCR蛋白表达降低,而LDLR表达增加。与Tx+T4组比较,注射TSH后HMGCR升高,且大剂量TSH升高更明显,而LDLR无明显变化。表明TSH注射增加肝脏HMGCR的表达,但对LDLR无明显影响。结论：1、本研究通过体外细胞实验和建立甲减模型的体内实验研究,证明了TSH可以增加肝脏胆固醇合成的关键酶HMGCR的表达,通过体外研究发现TSH的这种作用主要是通过cAMP/PKA/CREB信号通路实现的,且依赖于肝细胞膜上的TSHR。与体外实验研究一致,目前的研究发现切除了甲状腺的甲减大鼠肝脏HMGCR表达升高,血清胆固醇水平相应升高,通过体内实验研究发现这种升高是由于血清TSH水平升高造成的,也就是说TSH促进肝脏HMGCR表达,增加了肝脏胆固醇的合成。2、我们的研究揭示了高胆固醇血症一个新的发病机理,尤其是甲减相关的高胆固醇血症。因此,本研究对于理解和处理甲减相关的高胆固醇血症有重要的病理生理意义和临床应用价值。研究背景：在人类,饮酒与血糖升高、葡萄糖耐受不良和和葡萄糖体内稳态相关。已有报告短期饮酒可引起大鼠糖耐量异常。而对于周围组织来说,长期饮酒可降低肝脏和骨骼肌葡萄糖的利用。而且,长期饮酒损伤胰岛素受体信号。前期的研究通过葡萄糖钳夹实验已证明饮酒可降低心脏和骨骼肌胰岛素刺激的葡萄糖吸收。总之,饮酒不仅导致肝脏和骨骼肌的葡萄糖耐受,而且可引起酒精性心肌病。然而,心肌胰岛素信号的损伤和酒精性心肌病之间的关系至今不明确。尽管已有研究报道酒精损伤胰岛素信号和葡萄糖转运是由于降低了葡萄糖的氧化和利用,但是潜在的分子机制仍然不清楚。胰岛素在心肌代谢功能方面起着重要作用。胰岛素通过受体发挥各种生理作用,例如增加葡萄糖吸收,诱导基因表达和细胞增殖。胰岛素结合到受体,可激活胰岛素B受体酪氨酸激酶,进而激活胰岛素信号通路的下游分子,包括胰岛素受体底物家族。然而,有关酒精对胰岛素信号损伤的研究主要集中宅骨骼肌和脂肪组织,在心肌上几乎没有研究。组织对葡萄糖的摄取主要依赖于质膜上的葡萄糖转运体,心脏主要表达葡萄糖转运体1和4,而胰岛素依赖的葡萄糖吸收主要依赖于葡萄糖转运体4。本研究拟建立饮酒大鼠模型,观察长期饮酒对大鼠心肌胰岛素受体B亚基,胰岛素受体底物和葡萄糖转运体4表达的影响。研究目的：拟通过建立饮酒大鼠模型,观察长期饮酒对大鼠心肌胰岛素受体β亚基,胰岛素受体底物和葡萄糖转运体4表达的影响。研究方法：1、动物分组及喂养：雄性Wistar大鼠72只,按体重随机分为6组,每组12只,即对照组(蒸馏水：5g·kg-1·d-1)；大剂量饮酒组(酒精量5g·kg-1·d-1)；中剂量饮酒组(酒精量2.5g·kg-1·d-1)；小剂量饮酒组：(酒精量0.5g·kg-1·d-1)；酒精由胃管灌入,每天早9点定时灌胃,喂养时间22周。2、机体水平胰岛素敏感性评价：喂养期间监测大鼠体重和血糖水平；大鼠处死前,测空腹血糖、空腹血胰岛素和血脂水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),同时进行口服葡萄糖耐量试验。3、长期饮酒对经典的胰岛素信号传导通路的影响：RT-PCR检测心肌IR、IRS1、IRS2及GLUT4的mRNA水平；Western blot检测IR、IRS1、IRS2及其磷酸化和GLUT4的蛋白水平。研究结果：1、机体水平胰岛素敏感性评价：大鼠喂养22周后,各组大鼠口服葡萄糖耐量试验0、30、60、120分钟血糖无显著性差异,糖耐量曲线下面积亦无明显差别。2、与对照组比较,中等剂量和高剂量饮酒组大鼠心肌胰岛素受体B亚基,胰岛素受体底物1和葡萄糖转运蛋白体1的mRNA水平明显降低；相应地,心肌胰岛素受体B亚基,胰岛素受体底物1和葡萄糖转运蛋白体4的蛋白水平也明显降低,尤其是高剂量饮酒组大鼠。3、长期饮酒大鼠心肌磷酸化胰岛素受体β亚基和磷酸化胰岛素受体底物1的水平降低,这与心肌胰岛素受体β亚基、胰岛素受体底物1和葡萄糖转运体4蛋白水平的变化一致。结论：本研究表明长期饮酒可下调大鼠心肌胰岛素受体β亚基,胰岛素受体底物1和葡萄糖转运蛋白体1的表达。