花生是世界粮农组织认证的八大食物过敏原之一,花生可导致严重的过敏反应,甚至危及生命,且一般不随年龄的增长而消失。随着人们生活水平的提高,食物过敏的问题越来越受到关注,因此也越来越多的研究致力于降低花生过敏原的致敏能力。本文以花生中主要过敏原Ara h 2为研究对象,由于Ara h 2是花生蛋白中重要的过敏原,因此降低Ara h 2的致敏性有重要的实际意义。本研究对微生物转谷氨酰胺酶(microbal transglutaminase,MTGase)与Ara h 2蛋白的反应体系中,不同条件对反应体系的影响进行了探究,分析了酶催化产物结构的变化,评估了加工后Ara h 2消化性及其潜在致敏性的变化。研究还将还原蛋白的交联产物进行分离,得到低聚物及高聚物,分析了它们的结构及性质的区别。研究的主要方法、结果及结论如下:1.MTGase催化还原Ara h 2产物在SDS-PAGE电泳上有大分子聚合物产生,说明蛋白发生了外交联反应,另外与天然Ara h 2相比,酶催化反应后Ara h 2单体条带发生下移,显示蛋白的结构变得更加紧凑,平均粒径减小,质谱鉴定证实Ara h 2发生了内交联反应。体系中还有脱酰胺反应发生,研究测定了MTGase催化的还前后蛋白溶液pH值的变化,发现溶液pH都升高,这是由于氨基脱落造成的。不论还原前后,每分子Ara h 2脱落游离氨的个数均大于2,证明体系中都有脱酰胺反应发生。因此,酶催化还原蛋白发生了三种反应,即:外交联反应,内交联反应,脱酰胺反应,而酶直接催化Ara h 2则仅发生了内交联和脱酰胺反应,未发现外交联。2.研究了蛋白浓度、反应温度及还原程度对MTGase催化Ara h 2反应体系的影响。对于MTGase催化还原Ara h 2的体系,蛋白浓度较高时有利于发生外交联反应,低浓度有利于发生内交联反应;还原则更有利于暴露谷氨酰胺残基,有利于蛋白发生脱酰胺作用。对于MTGase催化天然Ara h 2的体系,反应不受蛋白浓度的影响,而脱酰胺作用随着温度的增加而增强。3.利用质谱结合软件的方法,确定了内交联的交联位点,并利用圆二色谱,紫外光谱及荧光光谱检测了酶催化反应后Ara h 2二三级结构及表面疏水性的变化。酶催化天然蛋白只找到1对交联片段,而还原蛋白有18对交联片段,5个交联位点,其中13个片段都包含了过敏原表位,4个交联位点都在过敏原表位中,且涉及到的过敏原表位包含了Ara h 2 10个线性表位中的5个。酶催化的天然蛋白结构变化不明显,而还原可以打开蛋白结构,破坏α-螺旋结构,α-螺旋结构减少,同时β-折叠和无规则卷曲结构增多。还原蛋白交联产物中低聚物α-螺旋含量高于聚物,且紫外吸收低于高聚物,表面疏水性高于高聚物,表明低聚物蛋白有更紧密的结构。4.采用体外模拟胃肠消化的方法分析了MTGase催化对Ara h 2消化性的影响。天然Ara h 2耐胃消化,但经过胃消化后再经肠消化,Ara h 2可以被消化,在消化80min时仍有部分13kDa的片段存在。酶直接处理不改变Ara h 2的胃肠消化特性,而还原和交联处理则可以加快Ara h 2的消化速率,还原及交联产物在经过胃肠消化后,都可以全部被消化为小于3.5kDa的片段。且交联产物中高聚物的消化速率高于低聚物的消化速率,这主要是由于低聚物中内交联蛋白的紧密结构可以降低交联产物的消化速率。5.采用竞争抑制ELISA法检测MTGase催化对Ara h 2抗原性及潜在致敏性的影响。酶直接处理基本不改变Ara h 2的IgG结合能力,还原处理可以降低IgG结合能力,但是不显著,而还原后再交联则可以降低Ara h 2的IgG结合能力,且高聚物的IgG结合能力比低聚物降低的更多。IgE结合能力结果与IgG结合能力相似,同样是高聚物的结合能力最低。经过模拟胃肠消化后,仍然是高聚物的IgG结合能力最低。由于蛋白浓度较高时反应更倾向于产生高聚物,因此可以通过适当的增加蛋白浓度,促进外交联减少内交联,以期获得潜在致敏性较低的加工产物。