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土霉素作为应用最广、使用量最大的四环素类抗生素,在环境中的大量残留对生命健康和环境生态安全造成巨大威胁,探索高效、环境友好型的技术措施进行土霉素残留废水、废物的异位处理和土霉素污染环境的原位修复意义重大。基于微生物技术在有机污染物治理修复中的优势,同时考虑生物安全性问题,本研究以前期获得的土霉素高效降解菌Arthrobacter nicotianae OTC-16为对象,通过黄瓜盆栽试验,开展在根际病原真菌和农药存在条件下OTC-16菌株对土壤中土霉素的去除效果研究;对该菌株应用下的土霉素降解代谢产物进行鉴定和生态毒性评估;探索降解菌OTC-16的染色体以及质粒上存在的五个抗生素抗性基因在土霉素降解过程中的表达,并借助土壤培养实验分析OTC-16施用下菌源抗生素抗性基因在土壤中的丰度变化。研究结果如下:(1)通过纸碟法和室内盆栽模拟试验了土霉素高效降解菌OTC-16在黄瓜根际土壤的降解菌-根际病原真菌-农药这个综合系统中降解菌的降解效应和响应机制。实验结果表明,在黄瓜根际土壤引入土霉素降解菌OTC-16能促进土霉素的分解,加速其降解进程,且菌株具有广泛的环境适应性。然而个别环境因子,如本实验中病原真菌和杀菌剂福美双的存在可能因为抑制了降解菌株的生长而影响了其降解效果。(2)以对土霉素敏感的大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细菌菌株以及水生生物斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)作为指示生物,评估了土霉素降解产物的生态毒性。实验结果表明,在72 h内,B.subtilis和E.coli在经过降解菌OTC-16处理过的土霉素处理液中的生长情况明显好于未添加降解菌的阴性对照和土霉素自然水解的处理,与无添加土霉素的阳性对照相比无显著差异。表明,经过OTC-16菌株降解的土霉素代谢产物与原药相比,其生物毒性大大降低。土霉素降解产物对藻类S.obliquus的毒性试验结果与细菌具有一致性。S.obliquus在经过OTC-16降解菌株处理过的土霉素溶液中的生长情况明显优于土霉素自然水解的处理和阴性对照。值得一提的是,与无添加土霉素的阳性对照相比,添加了降解菌株OTC-16的土霉素处理中藻细胞叶绿素含量却有较大差异,说明经过菌株降解的土霉素降解产物虽然对S.obliquus的细胞增殖没有较大影响,但是对其叶绿素合成仍有一定的负面作用。在透射电镜下观察其细胞超微结构发现,S.obliquus在经过土霉素降解菌降解过的土霉素溶液中其细胞结构状况好于细胞叶绿体及细胞壁受损的土霉素自然水解的处理和阴性对照,由此再次证明降解菌OTC-16能对土霉素进行生物转化,并最终降低其在环境中的生态毒性。利用液质联用(HPLC-Q-TOF-MS)技术检测土霉素的降解产物,发现降解体系中除了含有少量的土霉素自然水解产物差向土霉素(EOTC)、异土霉素(ISO-OTC)和脱甲基土霉素(TP447),另外还包含了大量特殊的生物降解产物氨基苯甲酸。而降解产物毒性的降低可能与体系中高毒性的EOTC被转化成无毒的氨基苯甲酸有关。(3)从实验室前期得到的菌株OTC-16的全基因组测序结果中发现,染色体以及质粒上存在5个抗生素抗性基因tet V、sul1、tet33、ant2ia、cml_e8。利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术追踪了土霉素诱导下降解菌的5个抗性基因的表达情况。结果表明,土霉素的添加明显促进培养早期降解菌中ant2ia、sul1和tet33的转录,但不影响或抑制基因tet V和cml_e8。结合5个抗性基因在降解菌基因上的位置,可知质粒来源的抗性基因往往具有较高的表达活性。同时,土壤培养实验结果表明,降解菌OTC-16添加10d后,位于质粒2上的3个基因tet33、ant2ia和sul1的丰度明显提高。综合抗性基因的表达活性及其在土壤中的富集情况,可知基因tet33、ant2ia和sul1具有较高的环境风险,对该质粒的剔除或对其携带抗性基因的敲除可能减少菌株在环境发挥降解作用时的安全隐患。