【摘 要】
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环状RNA是一类新型的非编码RNA,是m RNA前体反向剪切形成的共价闭合环状结构,在细胞分化、代谢、胚胎发育、神经发育和人类疾病发展中发挥重要作用。Circ-Fox O3来源于亲本基因Fox O3第二外显子环化形成的产物,研究表明,Circ-Fox O3在细胞分化、癌症发生等方面发挥重要作用。本研究以分离培养的牛肝细胞为试验材料,研究了高温对牛肝细胞增殖、凋亡和自噬及Circ-Fox O3基因表
【基金项目】
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重庆市自然科学基金面上项目（项目编号:cstc2020jcyj-msxm X0436）；
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环状RNA是一类新型的非编码RNA,是m RNA前体反向剪切形成的共价闭合环状结构,在细胞分化、代谢、胚胎发育、神经发育和人类疾病发展中发挥重要作用。Circ-Fox O3来源于亲本基因Fox O3第二外显子环化形成的产物,研究表明,Circ-Fox O3在细胞分化、癌症发生等方面发挥重要作用。本研究以分离培养的牛肝细胞为试验材料,研究了高温对牛肝细胞增殖、凋亡和自噬及Circ-Fox O3基因表达的影响,同时构建了Circ-Fox O3基因的过表达载体和干扰si RNA,研究Circ-Fox O3对高温状态下牛肝细胞增殖凋亡和自噬的作用,并利用双荧光素酶报告系统探究Circ-Fox O3对高温状态下牛肝细胞增殖凋亡和自噬中的作用机制,为缓解肉牛热应激提供理论依据。本试验的主要研究成果如下:1.高温影响牛肝细胞凋亡和自噬及Circ-Fox O3的表达通过对牛肝细胞施加不同时间的高温处理（0 h、2 h、6 h、12 h、24 h）,对牛肝细胞自噬和凋亡检测,发现牛肝细胞的凋亡和自噬程度和高温时间呈正相关,q RT-PCR结果显示Circ-Fox O3的表达随高温处理时间延长而上升。2.Circ-Fox O3参与高温状态下牛肝细胞凋亡和自噬的调控构建Circ-Fox O3过表达质粒及合成Circ-Fox O3 si RNA,将其与空质粒p LV-ci R和NC-si RNA分别转入牛肝细胞,结果显示Circ-Fox O3过表达能够极显著增加了细胞凋亡及凋亡相关基因caspase3、Ba X在m RNA水平上的表达,抑制了Bcl-2 m RNA水平上的表达,抑制细胞自噬及自噬相关基因P62、Beclin1、ULK1和LC3在m RNA水平上的表达。3.Circ-Fox O3通过mi R-153调控高温状态下牛肝细胞的凋亡和自噬根据生物信息学分析预测发现Circ-Fox O3与mi R-153存在潜在的结合位点,同时mi R-153可以调控ULK1基因的表达。将mi R-153 mimics和NC-mi R-153分别转染牛肝细胞,结果显示过表达mi R-153会抑制牛肝细胞凋亡,促进牛肝细胞自噬,过表达mi R-153下调Circ-Fox O3的表达,促进ULK1的表达。将包含Circ-Fox O3与mi R-153特异结合位点的目的片段重组入psi-CHECK报告载体中,并对结合位点进行定点突变,将野生型和突变型psi-CHECK报告载体分别与mi R-153 mimics、NC-mi R-153转染至牛肝细胞,双荧光素酶活性检测结果显示,和对照组相比,野生型组双荧光素酶活性显著降低,突变型载体无显著性变化,由此可知,Circ-Fox O3通过海绵吸附mi R-153解除其对ULK1的促进作用。综上,高温条件下牛肝细胞中Circ-Fox O3表达量升高,高温促进细胞凋亡,抑制细胞增殖和自噬。Circ Fox O3促进了高温状态下牛肝细胞的凋亡,抑制细胞的增殖和自噬,mi R-153可以通过与Circ-Fox O3靶向结合,通过Circ-Fox O3/mi R-153/ULK1轴参与高温造成的细胞自噬和凋亡的发生。
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