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低氧是任何一种生理性氧量不足或组织需氧量不足的状态。由于大气压的降低引起的缺氧称为低压性低氧(hypobaric hypoxia),高原低氧属于低压性低氧。而多种疾病如心肺功能衰竭、肿瘤等病理生理过程也与低氧密切相关[1]。机体对低氧的反应和适应是一个多层次和机制复杂的调控过程。在组织器官水平表现在造血系统的激活或红细胞增加,以及呼吸系统功能改变等。而久居高原的人们在长期进化过程中机体形成了一系列适应低氧环境的生理机制。细胞水平的改变包括细胞形态结构、特征以及生物学特性生长改变。细胞生长因子分泌和细胞代谢改变是多种细胞低氧反应的共同特征,受基因组、转录和表观遗传改变等多层次环节的调控。 不同细胞类型对低氧反应的程度和特点不同。造血系统是由造血微环境和造血细胞组成,是对低氧反应最敏感的系统之一。骨髓微环境分泌多种细胞因子调节造血细胞的粘附、迁移,归巢和增殖分化。一般认为造血微环境保持一种低氧状态。骨髓间充质干细胞是骨髓微环境的重要细胞组成部分,也是研究细胞低氧反应的理想模型。 细胞对低氧适应的调节中,特异性 miRNAs可调控大量编码蛋白基因的表达并发挥重要调控作用。多种重要的miRNAs通过调控HIFs参与低氧适应的调节,导致血管生长因子的表达变化从而影响细胞的生物学特性。miR-17-92基因簇含有的6个miRNA,包括miR-17、miR-18、MiR-19a、miR-19b、miR20和miR-92的基因肿瘤miRNA簇。它在肿瘤的发生和发展过程中,可通过调控内皮细胞的增殖和迁移发挥促血管新生的作用。但其是否参与低氧调控及机制并不清楚。细胞线粒体是受低氧影响最敏感的细胞器之一。Ptpmt1是位于细胞线粒体上的线粒体蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成员,参与能量代谢,被证明与心磷脂合成有关。考虑到Ptpmt1在细胞中能量代谢和磷脂类物质代谢中的重要性,阐明它与低氧的关系及其它信号的关联性将具有重要意义。SPK是合成 S1P并维持细胞内脂类代谢产物平衡的重要限速酶,也是细胞代谢的重要细胞信号分子。SPK低氧调节并参与促血管新生。低氧能够激活多条细胞存活相关的信号通路,如PI3/AKT、Sirt1、MAPK等,而SPK和这些信号通路存在很广泛的关联性。SPK又是一个低氧诱导的反应分子,其介导 SPK/S1P信号通路无疑在低氧导致的异常能量代谢过程中发挥重要的调控作用。阐明其和SPK调控Ptpmt1的信号对糖代谢作用的影响及协同作用,将更深入阐释细胞低氧反应的机制。 本课题利用间充质干细胞和红系白血病细胞系TF-1为模型,从miRNA和细胞信号水平,研究了低氧调控细胞因子分泌及糖代谢的作用与机制。阐明了miR-17-92在低氧诱导BM-MSCs细胞因子分泌的作用;证明了线粒体酪氨酸磷酸化酶1(Ptpmt1)是一个低氧诱导的线粒体能量代谢相关分子;并证明了磷酸鞘氨醇信号和Ptpmt1参与细胞增殖、存活及能量代谢的调节。 一、miRNA17-92调控低氧诱导BM-MSCs分泌血管生长因子 BM-MSCs能够分泌的各种细胞因子,包括HGF、VEGF和ANG-1等。已知低氧预处理能够提高BM-MSCs分泌血管生长因子的能力,并提高BM-MSCs治疗缺血性疾病的效果。但是,低氧诱导血管生长因子分泌的作用和机制还不清楚。特异性的microRNA是低氧诱导细胞生物学反应的重要的调控环节。miRNA-17-92是与肿瘤发生和血管新生密切相关的microRNA簇。我们利用PCR、ELISA和基因转移等方法阐明了miR-17在BM-MSCs分泌血管生长因子中调控作用与机制。 实验利用贴壁培养方法,培养、鉴定并扩增了 BM-MSCs。BM-MSCs具有成脂和成骨分化的能力,表达CD73、CD90、CD105等间质分子,不表达CD11b、CD34、CD45等造血细胞的表面抗原。BM-MSC具有向成脂和成软骨分化的能力。低氧1% O2处理能够诱导BM-MSCs表达VEGF、HGF和ANG-1等血管生长因子,同时Hif-1α的表达水平也明显提高。与此同时,miR-17-92的表达检测结果表明,miR-17和 miR-18经低氧刺激后的表达水平明显降低。转染miR-17的抑制剂能够促进BM-MSCs分泌上述的血管生长因子,提示miR-17表达减低参与BM-MSCs分泌血管生长因子调控。慢病毒介导miR-17-92高表达能够增强BM-MSCs的增殖能力,但低氧状态下,其促增殖能力明显低于常氧状态。我们研究结果提示miR-17是低氧诱导血管生长因子分泌的负调控分子。 Hif-1α是介导低氧诱导细胞促血管活性物质分泌的主要转录调节因子。利用生物信息学分析表明Hif-1α3′-UTR存在miR-17的结合序列。我们构建了miR-17的结合序列Hif-1α3′-UTR报告基因载体,利用荧光素酶报告实验证明了Hif-1α是miR-17的靶基因。miR-17模拟物转染BM-MSCs可抑制其Hif-1α的表达。从而证明了低氧下调miR-17表达,导致靶基因Hif-1α上调促进血管生长因子分泌的新机制。 二、SPK及Ptpmt1参与低氧导致糖代谢变化 低氧可引起人类和动物的细胞代谢失衡,包括线粒体功能障碍与氧化应激。然而,缺氧导致线粒体功能障碍和能量代谢失衡的机制仍不清楚。细胞膜磷脂代谢衍生物神经酰胺(ceramide,Cer)、鞘氨醇(sphingosine,Sp)及1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phospate,S1P)在调控细胞增殖、存活及能量代谢过程中发挥重要调控作用,其中S1P也是重要的促血管生成信号分子。鞘氨醇激酶(SPK)是细胞内合成S1P并调控细胞内Cer、SP、S1P代谢平衡的一种关键酶。线粒体酪氨酸磷酸化酶1(Ptpmt1)是线粒体特异的酪氨酸磷酸酶。我们利用人红白血病细胞系(TF-1)研究了SPK信号通路及Ptpmt1在低氧所致糖代谢紊乱中的作用,并探讨了SPK信号和Ptpmt1的关联性。 低氧培养或化学模拟低氧试剂(DFO)处理TF-1细胞都能够诱导Hif-1α、Hif-2α、SPK和Ptpmt1的上调。证明了SPK及Ptpmt1都是低氧诱导表达的分子。利用慢病毒介导Hif-1αshRNA、Hif-2α shRNA转染,建立了HIF-1α和HIF-2α沉默TF-1细胞系。确定了只有沉默Hif-2α shRNA才能降低Ptpmt1的表达,表明Ptpmt1是Hif-2α的下游分子。为阐明SPK信号和Ptpmt1在低氧诱导促进生成血管生长因子和能量代谢中的作用。我们构建了携带 SPK-shRNA、Ptpmt1-shRNA慢病毒载体并制备了慢病毒,感染TF-1细胞后能够有效干涉SPK和Ptpmt1的表达。利用RT-PCR和蛋白印迹技术证实了干涉效率。通过CCK-8测定细胞增殖活力,通过流式细胞仪检测 AnnexinV和 PI双标记确定细胞凋亡情况。发现SPK-shRNA和Ptpmt1-shRNA转染能够明显抑制细胞的增殖并且诱导细胞的凋亡。研究结果表明SPK和Ptpmt1是维持细胞增殖和存活的重要磷酸酶。我们进一步观察了敲低SPK和Ptpmt1表达的TF-1细胞的葡萄糖代谢的情况。SPK和Ptpmt1敲低能够明显减低细胞葡萄糖的利用和消耗。糖转运分子是细胞糖代谢的协同分子,我们利用RT-qPCR的方法发现Ptpmt1受抑制可以减少Glut1和 Glut3的表达,从而降低TF-1细胞葡萄糖的消耗。更有意义的是,通过JC1染色确定了Ptpmt1基因敲低可导致线粒体功能障碍。为确定SPK信号和Ptpmt1之间的相关性,我们利用慢病毒转导shRNA或SPK抑制剂DMS抑制TF-1细胞SPK活性。SPK抑制能够提高Ptpmt1的表达,表明这两个信号分子在细胞内存在相互作用和竞争性抑制关系。我们研究结果说明低氧上调 SPK和Ptpmt1在低氧诱导的糖代谢变化或能量代谢中发挥关键作用。 综上所述,我们的研究结果揭示了miR-17/Hif-1α是低氧调控细胞生长因子分泌的重要信号通路;SPK和Ptpmt1参与低氧导致的细胞糖代谢异常和线粒体功能异常,为高原低氧相关疾病诊断和治疗提供了理论基础。