myb基因是真核生物中广泛存在的一类结构保守、功能复杂的基因,已有的研究表明myb是以多基因家族成员的形式存在.myb基因编码的蛋白具有以下的结构特征:N端的DNA结合域由二个或三个进化上高度保守的约51个氨基酸的"myb motif"基序重复构成.在动物中,MYB主要由三个进化上高度保守的Myb基序构成,它主要控制细胞增殖、分化和凋亡.在植物中,MYB主要是由两个进化上高度保守的序列构成,是植物中已知的最大的调控基因家族,其功能非常复杂:在次级代谢的调控、细胞形态建成和分化、植物激素应答、抗病反应以及细胞周期调控过程中均起重要作用.单细胞原生动物属于单细胞的真核生物,在单细胞原生动物纤毛虫中已经发现myb的身影:在纤毛纲中的Sterkiella histriomuscorum和Euplotes aediculatus中均各自发现一个myb基因(杨铁,2002).已有的研究表明Myb基因家族是重要的转录调控因子,它可能是调控细胞凋亡和衰老的重要枢纽.全面了解myb基因在单细胞原生生物中的类型和表达特点,为进一步了解myb及其所调控的下游靶基因群与衰老和增殖的关系打下基础. 该研究以Euplotes aediculatus为实验材料,碱裂解法制备基因组DNA,经过透析纯化,获得了一定长度范围(大约400bp-20kb左右)的高纯度基因组DNA.用Sma I酶切pUCl8质粒,获得平末端质粒载体,对载体进行去磷酸化反应,以降低载体的自连接度.根据Euplotes aediculatus基因组DNA的独特性,直接用T1DNA聚合酶(具有3→5外切核酸酶活性及5→3DNA合成酶活性),进行基因组中DNA的3突出末端的平滑化反应,形成平末端后的基因组DNA经磷酸化反应,再与经过处理的载体DNA连接.连接产物电击转化如JM109大肠杆菌菌株中,所得基因组DNA文库通过铺平板,得以扩增和保存.扩增前后均进行滴度鉴定该文库包含1.4X105个重组子.挑取部分克隆进行酶切鉴定,并送出部分阳性克隆进行测序,可以看到基因组DNA中插入片段的完整性.同时,对纤毛虫及拟南芥等的myb基因的蛋白同源性进行比较,设计了Euplotes aediculatus PCR扩增引物,从己建的文库中获得了4个myb基因的同源序列. 该研究获得了Euplotes aediculatus中的myb的基因家族新成员序列,为了解myb基因家族在单细胞原生动物中的表达特点,以及与衰老的关系研究奠定基础.