Newbury-1 virus目前是杯状病毒科(Caliciviridae family)纽布病毒属(Nebovirus genus)唯一成员,常用Nebovirus(NeV)表述。NeV为单股正链RNA病毒,是致犊牛腹泻的病毒。迄今为止,NeV已经在美国、英国、巴西、土耳其、日本等12个国家检出,具有广泛的地域分布。根据RdRp基因序列,NeV可以分为NB-like、NA1-like和Dijon A216-like 3种基因型;根据完整VP1序列,NeV可以分为2种基因型(基因1型和基因2型),其中基因1型又细分为4个谱系(谱系1~4)。目前,NeV在我国的存在及流行情况尚不清楚。本研究旨在调查NeV在我国的流行情况及其分子特征,取得了以下成果:1.我国部分地区奶牛NeV的分子检测和基因组研究采集新疆维吾尔自治区、四川省、辽宁省、河南省、山东省和陕西省23个养殖场的307份奶牛粪便样本(237份腹泻粪便样本,70份临床健康粪便样本),采用RT-PCR方法对NeV进行检测。结果显示,NeV在腹泻粪便样本的检出率(48.1%)显著高于健康粪便样本(5.70%,P<0.001),场阳性率为95.7%。6个省40株奶牛NeV RdRp基因片段之间的核苷酸相似性为91.8%~100%,与Gen Bank中所有NeV RdRp基因片段的核苷酸相似性为75.6%~90.0%。遗传进化分析显示,我国奶牛NeV毒株与NB-like毒株的遗传关系最近,但共同聚为独立的一大支,显示有共同的进化趋势。5个省28株奶牛NeV完整VP1之间的核苷酸相似性和氨基酸相似性分别为69.0%~100%和73.2%~100%,与Gen Bank中所有NeV VP1的核苷酸相似性和氨基酸的相似性分别为65.5%~94.7%和69.9%~98.7%。遗传进化分析显示,27株NeV毒株属于基因型1(21株为谱系1、4株为谱系3和2株为谱系4),剩余1株NeV毒株属于基因型2,表明我国奶牛NeV的VP1具有丰富的遗传多样性。成功获得Bo/LZB-1/CH/17毒株(基因2型)和Bo/YLA-2/17/CH毒株(基因1型谱系3)的完整基因组,其基因组大小均为7,453 bp。这2株NeV完整基因组之间的核苷酸相似性为88.9%,与已知的4株NeV基因组的核苷酸相似性为79.4%~87.5%。基于P34、NTPase、P30、VPg、3CLpro和RdRp蛋白的遗传进化分析表明,Bo/LZB-1/CH/17毒株和Bo/YLA-2/17/CH毒株遗传关系最近,但这2株NeV的VP1遗传关系很远(Bo/LZB-1/CH/17毒株VP1属于基因2型,而Bo/YLA-2/17/CH毒株VP1属于基因1型谱系3)。重组分析揭示Bo/YLA-2/17/CH毒株VP1的P1A发生了重组事件,Bo/LZB-1/CH/17毒株RdRp的3’端发生了重组事件。本研究首次证实NeV在我国的存在并在奶牛中广泛流行,显示出独特的进化特征,为我国奶牛腹泻的诊断和防控提供了重要参考。首次获得VP1基因2型和基因1型谱系3的基因组,并首次鉴定NeV的VP1 P1A区域和RdRp 3’端的重组事件,对深入了解NeV的分子特征和遗传进化有重要意义。2.牦牛NeV的分子检测和基因组研究采集西藏自治区、四川省和云南省55个牧场的354份牦牛腹泻粪便样本,采用RT-PCR方法对NeV进行检测。结果显示,NeV的检出率为22.0%,场阳性率为69.1%。3个地区78株牦牛NeV RdRp基因片段之间的核苷酸相似性为63.1%~100%,与Gen Bank中NeV RdRp基因片段的核苷酸相似性为62.4%~97.2%。遗传进化分析显示,69株牦牛NeV毒株与我国奶牛中NeV毒株遗传关系最近,均为NB-like基因型;剩余9株牦牛NeV毒株共同聚为独立的一大支,区别于已知的NeV RdRp基因型,可能代表一种RdRp新基因型,建议命名为SC-Yak。2株具有潜在新RdRp基因型的NeV毒株(YAK/NRG-17/17/CH和YAK/HY1-2/18/CH毒株)的完整基因组被成功测序,其基因组大小分别为7,459 bp和7,460 bp,其5’-UTR分别为78bp和79 bp,3’-UTR均是66 bp。这2株牦牛NeV完整基因组之间的核苷酸相似性为90.2%,与Gen Bank中所有6个NeV基因组的核苷酸相似性仅为68.1%~69.3%。分析其VP1序列也表明这2株牦牛NeV的VP1可能代表一种VP1新基因型,建议命名为基因3型。基于基因组、VP1、RdRp、VP2、P34、NTPase、P30、VPg和3CLpro蛋白的遗传进化分析均显示,YAK/NRG-17/17/CH毒株和YAK/HY1-2/18/CH毒株共同聚为独立的一个大支,代表一种新型NeV毒株。有趣的是,基于VP1和RdRp序列,从四川省红原县和若尔盖县的6个牧场中检测到9株(11.5%)具有RdRp新基因型和VP1新基因型的NeV毒株,表明这种新型NeV已在当地牧场中流行。本研究首次证实了NeV在牦牛中存在并广泛流行,为牦牛腹泻疾病提供重要参考。在牦牛中鉴定了一种具有RdRp新基因型和VP1新基因型的NeV毒株,并获得了2株完整基因组,有助于了解NeV的遗传多样性。3.检测NeV的real-time RT-PCR方法的建立NeV RdRp 3’端序列是分子检测靶点,本研究前期发现国内NeV RdRp有独特的进化趋势;与国外NeV毒株相比,国内RdRp 3’端序列存在不同程度的点突变,有可能会影响RT-PCR方法对NeV的检出率。本研究的目的是建立检测NeV的real-time RT-PCR方法。根据本研究前期扩增的RdRp序列设计引物,通过反应条件和体系优化,成功建立了基于TB Green检测NeV的real-time RT-PCR方法。该方法在2.9×101~2.9×109 copies/μL之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R2=0.9994,扩增效率为98%;该方法只特异性检出NeV,对常见无关病原不检出;最低检测下限为29 copies/μL;批内和批间的变异系数分别为0.89%~1.89%和0.83%~1.15%。检出率比较实验表明,该方法对45份奶犊牛腹泻样本NeV的检出率(68.8%)显著高于国外文献报道的SYBR Green real-time RT-PCR(28.8%)、巢氏RT-PCR(44.4%)和常规RT-PCR方法(13.3%);该方法检出的阳性样本包括其它3种RT-PCR方法检出的阳性,且全部阳性经测序证实均为NeV。该方法具有特异性和稳定性好,灵敏度高的特点,为NeV的检测和流行病学调查提供了可靠的手段。