【摘 要】
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目的1.寻找氧化应激系统中与胆囊癌发生和耐药相关易感基因。2.探讨Nrf2、活性氧（ROS）以及氧化应激相关基因之间相互作用,及其影响胆囊癌耐药性的机制。3.探讨胆囊癌细胞背景中Nrf2表达情况及调控机制4.根据Nrf2通路寻找促进胆囊癌化疗敏感性的临床药物。方法1.流式细胞术分选SP细胞,并检测细胞内ROS水平及细胞凋亡率。明确SP细胞耐药属性后,寻找与非SP细胞的差异表达基因,验证该基因对SP
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81272748,81472240）
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目的1.寻找氧化应激系统中与胆囊癌发生和耐药相关易感基因。2.探讨Nrf2、活性氧（ROS）以及氧化应激相关基因之间相互作用,及其影响胆囊癌耐药性的机制。3.探讨胆囊癌细胞背景中Nrf2表达情况及调控机制4.根据Nrf2通路寻找促进胆囊癌化疗敏感性的临床药物。方法1.流式细胞术分选SP细胞,并检测细胞内ROS水平及细胞凋亡率。明确SP细胞耐药属性后,寻找与非SP细胞的差异表达基因,验证该基因对SP细胞耐药影响。2.在临床样本中验证该基因通路表达差异是否具备临床意义。3.RNA干扰及质粒过表达改变胆囊癌细胞内目的基因表达水平,荧光定量PCR及免疫印迹分别检测组织或细胞内m RNA和蛋白水平,判断目的基因对胆囊癌耐药表型的影响及下游机制。4.探索胆囊癌细胞中目的基因的上游调控机制,明确胆囊癌背景下分子自身稳定性调控机制及上游关键基因。5.利用所关注的耐药调节基因寻找相应通路具体靶向药物,进行耐药研究和机制探索,助力临床转化。结果1.SP细胞分选后显示出更强的耐药特性和更低的ROS水平,与非SP细胞进行差异表达基因分析,发现Nrf2表达水平对胆囊癌SP细胞耐药性影响显著,选定Nrf2及下游通路靶基因作为胆囊癌耐药的研究对象。2.选取胆囊癌和正常胆囊组织临床样本初步检测发现,Nrf2表达量在胆囊癌组织中更高。扩大样本量验证后发现Nrf2及下游基因确实在胆囊癌组织中高表达。3.质粒过表达及RNA干扰改变胆囊癌细胞内Nrf2表达水平,荧光定量PCR及免疫印迹实验分别检测细胞内m RNA和蛋白水平,鉴定后发现Nrf2下游基因与之同步变化,Nrf2表达可以降低细胞内ROS水平,增强胆囊癌细胞耐药。4.使用Nrf2 Neh3结构域缺失的胆囊癌细胞系进行耐药实验,发现缺失后细胞增殖和耐药能力增强,Nrf2核内积聚,表达量升高,下游通路激活。5.在组织样品中进行Nrf2测序,寻找Nrf2 Neh3结构域突变位点,发现GSK3β-Fyn通路对Nrf2 Neh3结构域的具有调节作用。结论1.Nrf2及下游信号通路与胆囊癌的耐药性相关。2.Nrf2 Neh3结构域影响Nrf2表达量及活性,改变胆囊癌耐药。3.Nrf2 Neh3结构域位点突变影响Nrf2出核,改变胆囊癌耐药
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