目的:近些年来,经皮穿刺腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)和经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention,PCI)已逐渐成为冠心病及急性冠脉综合征血运重建的重要治疗手段。然而,术后再狭窄(restenosis,RS)却制约着这项技术的应用与发展。尽管药物洗脱支架的问世在一定程度上降低了再狭窄的发生率,但是越来越多的研究发现药物洗脱支架也并非十全十美,仍面临如远期炎症状态、支架内血栓形成以及RS等等问题。基于此,我们拟探究是否存在更好的再狭窄预防手段,以期与现有的保护措施结合起来,进一步降低这种并发症的发生率。Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)是哺乳动物TLR家族里第一个被发现的膜受体,其活化后可以激活核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB),继而诱发一系列的局部炎症反应,最终表现为损伤部位内膜增生,因此推测其在血管损伤后再狭窄过程中可能发挥重要作用。但是抑制TLR4表达后是否会减少再狭窄的发生尚不明确。本研究通过RNA干扰技术下调TLR4基因,以病毒颗粒包装将质粒载入动物RS模型以及被脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激增殖下的人主动脉血管平滑肌细胞(Human aortic vascular smooth muscle cells,Ha VSMC)中,测定TLR4相关的炎症、增殖分子,观察下调TLR4对内膜新生的抑制程度,以及离体水平细胞增殖、迁移能力产生的影响,探讨抑制TLR4基因表达在预防RS中的作用机制。此外,我们比较了RNA干扰与不同浓度吡格列酮对细胞增殖迁移能力的抑制效力。方法:1.在体实验:根据本实验室前期工作基础,建立兔颈总动脉球囊损伤后再狭窄模型:选取健康新西兰大白兔50只,随机分成五组,即正常组(normal control,NC),假手术组(shame,S),模型组(model,M),阴性质粒转染组(negative,N),以及阳性质粒转染组(positive,P),每组10只。NC组不予任何干预;S组行颈总动脉分离后动脉夹夹闭右侧颈总动脉30分钟;M组行右颈总动脉球囊拉伤术;N组在进行右侧颈动脉球囊拉伤后随即封闭拉伤段血管,排空积血,管腔内注射空载的腺病毒颗粒(滴度1*109 plaque forming unit,pfu)30ul,温暖潮湿环境孵育30min;P组在进行右侧颈动脉球囊拉伤后管腔内注射载有sh RNA-TLR4质粒的腺病毒颗粒(滴度1*109 pfu)30ul,余操作同N组。术后正常兔料喂养14天后处死,进行以下步骤:(1)处死前取血,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆中TNF-α、IL-6水平;(2)留取右颈动脉标本,进行HE染色,测量内膜和中膜厚度并计算内膜和中膜面积;应用免疫组化法观察组织TLR4表达。(3)留取右颈动脉标本,采用Real-Time PCR测定TLR4、TNF-α、IL-6和VCAM-1m RNA表达;(4)Western blotting检测TLR4,炎症因子NF-κB、VCAM-1、MCP-1以及增殖因子t-AKT、p-AKT、t-m TOR、p-m TOR蛋白的表达。2.离体实验:选取Ha VSMC细胞系,分别予1μg/ml LPS刺激0h、6h、12h、24h以及48h,确定TLR4表达的峰值时间点。设计、构建2对针对TLR4特异性的sh RNA表达质粒,进行慢病毒包装,使用带有绿色荧光蛋白的慢病毒载体介导的sh RNA-TLR4-1,sh RNA-TLR4-2和阴性对照质粒转染人血管平滑肌细胞系,在荧光倒置显微镜下检测以确认转染效果,并选择TLR4抑制效率更高的一组作为sh RNA阳性转染组(positive,P),另外保留阴性转染组(negtive,N),不加LPS刺激组(NL)以及单加LPS刺激组(L),再设三组分别给予10μmol/L(Pio10),50μmol/L(Pio50),以及100μmol/L(Pio100)吡格列酮进行预处理,除NL外各组分别予1μg/ml LPS刺激使TLR4表达达到峰值,收细胞,RT-PCR测定TLR4 m RNA表达;Western blotting检测TLR4、NF-κB、VCAM-1、MCP-1,再测接受LPS刺激1h后上述各组t-AKT、p-AKT的蛋白表达;MTT比色法分别测定细胞增殖生长状况;划痕实验测定细胞24h及48h划痕修复率;流式细胞术检测细胞周期分布情况。结果:1.在体部分实验结果:(1)有创操作成功且存活占83.3%(40/48);(2)ELISA结果显示:与NC组相比,S、M、N和P组血浆IL-6、TNF-α表达水平显著升高(p<0.05);与M及N组比较,P组血浆IL-6、TNF-α表达无统计学差异(p>0.05);(3)HE染色结果显示,与NC组和S组相比,M、N和P组内膜和中膜均增厚,内中膜厚度比及内中膜面积比均明显增大(p<0.05);与M和N组相比,P组内中膜厚度、内中膜厚度比及内中膜面积比均明显减少(p<0.05)。免疫组化结果表明:NC组及S组血管三层结构中均未见到TLR4阳性表达细胞;M、N及P组均有TLR4阳性表达细胞,主要分布在新生内膜层;(4)q RT PCR结果显示:与NC组和S组相比,M、N和P组TLR4、IL-6、TNF-α和VCAM-1 m RNA表达量升高(P<0.05),与M组及N组相比,P组上述因子表达量降低(P<0.05);(5)Western-blot结果显示:与NC组和S组相比,M、N和P组TLR4、NF-κB、MCP-1、VCAM-1、p-AKT和p-m TOR蛋白表达量升高(P<0.05);与M和N组相比,P组TLR4、NF-κB、MCP-1和VCAM-1蛋白表达量下降(P<0.05),p-AKT和p-m TOR蛋白表达量无明显变化(p>0.05)。2.离体部分实验结果:(1)1μg/m L LPS刺激Ha VSMC可激活TLR4,并呈现时间依赖性,24h达到其表达峰值;(2)两条sh RNA-TLR4质粒转染进入细胞对TLR4抑制效率可达61%及55%;(3)q RT-PCR示P组及吡格列酮预处理各组均可下调TLR4 m RNA表达量;(4)WB示各组TLR4、NF-κB、MCP-1及VCAM-1表达及关系与q RT-PCR结果类似,LPS刺激后1h即可上调p-AKT表达量,而sh RNA-TLR4质粒及吡格列酮均可明显抑制其表达;(5)LPS可以提高细胞增殖能力,sh RNA-TLR4质粒及吡格列酮能够抑制增殖;(6)流式细胞术分析发现,LPS可以提高细胞在G2及S期的分布,sh RNA-TLR4质粒及吡格列酮可减弱此效应;(7)LPS促进细胞迁移,sh RNA-TLR4质粒及吡格列酮可抑制迁移;(8)以上吡格列酮对于细胞增殖、迁移能力的抑制以及对细胞周期分布的影响呈浓度依赖性,对上述各炎症因子表达的下调作用也存在浓度依赖性。(9)sh RNA-TLR4稳转Ha VSMC细胞系对细胞增殖及迁移能力的抑制程度介于50μM-100μM吡格列酮之间。结论:下调TLR4可以抑制家兔颈动脉球囊损伤后再狭窄的发生,可能与其抑制局部组织TLR4及其介导的NF-κB、TNF-α、IL-6、MCP-1、VCAM-1等炎症因子的表达有关。下调TLR4可以抑制由LPS激活的Ha VSMC增殖迁移,其作用类同于50μM-100μM吡格列酮所达到的效果,提示TLR4可以作为基因水平预防支架内再狭窄的新靶点。