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目的：硝苯地平是一种重要的二氢吡啶类钙离子拮抗剂,主要用于治疗心血管疾病,因其临床疗效确切且价格低廉,应用十分广泛。但经大量研究发现,硝苯地平的处置具有较大的个体差异,目前认为这种差异可能是由遗传因素造成的。硝苯地平是CYP3A4和CYP3A5的经典底物,可被代谢转化为无药理活性的氧化硝苯地平,而CYP3A4*1G和CYP3A5*3在中国汉族人群中存在较高的频率,且已证实其突变对他汀类等许多药物的代谢和疗效均有影响。因此,我们推测导致硝苯地平代谢出现个体差异的遗传因素可能是CYP3A4和CYP3A5的基因多态性。另外,有研究表明高脂饮食能够影响阿雷地平的药动学和药效学,同为脂溶性较强的药物,硝苯地平的代谢是否也受高脂饮食的影响?本实验拟研究CYP3A4*1G和CYP3A5*3基因多态性及高脂饮食对硝苯地平药物代谢动力学的影响,试图寻找硝苯地平处置个体差异的遗传标志物和食物因素,从而为临床上使用硝苯地平提供个体化用药依据。
方法：⑴共90名健康志愿者参与该项研究。空腹组:45名健康受试者,男32例,女13例,平均年龄23.13±1.89y,平均体重65.17±7.96 kg,平均身高170.03±7.25 cm;高脂餐组:45名健康受试者,男23例,女22例,平均年龄23.22±2.49y,平均体重59.19±8.47 kg,平均身高165.92±8.53 cm。经血尿常规、肝肾功能及心电图检查,各项检查指标均正常。本研究得到郑州大学第一附属医院伦理委员会批准,各受试者均自愿参与试验并于试验前由本人签署知情同意书。⑵受试者在试验前2周内未服用任何药物。空腹组在服药前禁食10 h,服药后4h进统一标准餐;高脂餐组在服药前30 min进高脂餐,并在25 min内进餐完毕,服药后4h进统一标准餐。90例志愿者均于早晨8点口服硝苯地平片90 mg,用240ml温开水送服,分别于服药前、服药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、20、24、36和48 h取静脉血5 ml,置EDTA抗凝试管中,1 h内离心和分离血浆,-80℃保存待测。⑶将空腹组受试者按CYP3A4*1G和CYP3A5*3进行基因分型,分别比较CYP3A4和CYP3A5不同基因型之间的药动学参数,拟寻找导致硝苯地平体内代谢个体差异的遗传因素;比较空腹组与高脂餐组受试者之间的药动学参数,以探讨高脂饮食对硝苯地平体内代谢的影响。⑷采集空腹组受试者外周静脉血2 ml,用“酚-氯仿”法提取基因组DNA;采用聚合酶链反应(PCR)方法扩增CYP3A4和CYP3A5目的片段,PCR产物经限制性片段长度多态性(RFLP)分析。根据CYP3A4基因型将受试者分为3组:CYP3A4*1/*1(野生纯合子)29例,CYP3A4*1/*1G(突变杂合子)12例,CYP3A4*1G/*1G(突变纯合子)4例:根据CYP3A5基因型将受试者也分为3组:CYP3A5*1/*1(野生纯合子)3例,CYP3A5*1/*3(突变杂合子)18例,CYP3A5*3/*3(突变纯合子)24例。⑸色谱柱为Phenomenex Hydro-RP80A(2.0×150 mm,4μm)柱,流动相(含0.05％蚁酸和2 mM醋酸铵)为乙腈:水=60:40,流速0.4 ml/min,柱温为25℃;离子源为ESI源,源电压1.5 KV,加热模块温度200℃,干燥气流速0.5 L/min,负离子模式检测,扫描方式为选择反应监测(SRM),用于定量的离子分别为硝苯地平m/z:345.1/122.1,内标(硝苯地平-d6)m/z:351.1/122.1。样品处理:吸取50μl稀释液(50%甲醇),分别加入到50μl含有质控样品(QC)、检测样品、双空白及空白样品血浆样品中;向标准液、空白、质控样品及检测样品中各加入20μl内标溶液(硝苯地平-d6,20 ng/ml),双空白中加入20μl稀释液;向各管中分别加入300μl乙腈,1000 rpm涡旋10 min;6000 g离心10 min,取50μl上清液加入250μl超纯水,1000 rpm涡旋10min;取10μl进行LC-MS/MS分析。⑹用3p97软件计算药动学参数。采用SPSS13.0统计软件处理数据,所有数据均以-x±s来表示。CYP3A4和CYP3A5三种基因型之间药动学参数的比较采用单因素方差分析,空腹组与高脂餐组之间药动学参数的比较采用t检验。P＜0.05认为有统计学意义。
结果：①硝苯地平药时数据按权重系数为1/C2拟合度最好。标准曲线y=0.101 x+0.00155,回归系数r2=0.99911,线性范围0.5-250ng/ml,最低检测限为0.5 ng/ml;平均回收率为97.9%,日内、日间变异范围＜15%,样品稳定性良好。方法准确度、灵敏度、稳定性均符合生物样品分析要求。②CYP3A4*1/*1、CYP3A4*1/*1G和CYP3A4*1G/*1G的曲线下面积AUC0-48h分别为1878.58±597.60 ng·h/ml、1769.76±515.78 ng·h/ml和1510.51±331.73 ng·h/ml,三者之间的AUC0-48h无显著性差异(P=0.535);曲线下面积AUC0-∞在CYP3A4*1/*1、CYP3A4*1/*1G和CYP3A4*1G/*IG中分别为2071.79±733.21ng·h/ml、1807.26±501.54 ng·h/ml和1545.89±290.50 ngh/ml,AUC0-∞在三个基因型之间也无统计学意义(P=0.287);血浆吸收半衰期(T1/2Ka)和消除半衰期(T1/2Ke)在CYP3A4*1/*1、CYP3A4*1/*1G和CYP3A4*1G/*1G中分别为2.09±1.62 h、1.85±1.59 h、2.29±1.75 h和11.04±6.34 h、7.82±1.80h、8.55±3.98 h,T1/2Ka和T1/2Ke在三组之间均无统计学意义(P=0.875;P=0.212);峰浓度(Cmax)和达峰时间(Tmax)在CYP3A4*1/*1、CYP3A4*1/*1G和CYP3A4*1G/*1G三种基因型中分别为148.95±54.57 ng/ml、137.10±43.74 ng/ml、121.05±89.22ng/ml和3.80±1.75 h、4.25±1.29 h、6.50±6.61h,突变纯合子与野生纯合子、突变杂合子相比,Tmax具有延长趋势,Cmax有降低趋势,但均未达到显著性差异(P=0.630;P=0.145)。③CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3和CYP3A5*3/*3的AUC0-48h分别为1065.82±143.87 ng·h/ml、1705.88±487.28 ng·h/ml和1994.44±565.98 ng·h/ml,CYP3A5*3/*3与CYP3A5*1/*1相比显著增大,三者之间的AUC0-48h具有统计学意义(P=0.048);CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3和CYP3A5*3/*3的AUC0-∞分别为1186.08±96.51 ng·h/ml、1766.72±468.25 ng·h/ml和2387.96±1309.14 ng·h/ml,CYP3A5*3/*3基因型的AUC0-∞较CYP3A5*1/*1显著增大,三种基因型之间的差异具有显著性(P=0.043);T1/2Ka和T1/2Ke在CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3和CYP3A5*3/*3三个基因型中分别为0.91±0.80 h、2.28±1.39 h、1.87±1.75 h和11.93±1.04 h、8.60±3.52 h、11.41±7.34 h,T1/2Ka和T1/2Ke在三者之间均无统计学意义(P=0.487;P=0.450);Cmax和Tmax在CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3和CYP3A5*3/*3三种基因型中分别为72.93±17.47 ng/ml、132.47±47.25 ng/ml、159.32±53.37 ng/ml和1.75±0.35 h、4.63±2.81 h、3.96±1.73 h,突变纯合子与野生纯合子、突变杂合子相比,Cmax有增大趋势,但无统计学意义(P=0.054),Tmax在三者之间的差异也未达到显著性(P=0.220)。④空腹组和高脂餐组的AUC0-48h分别为1818.33±557.48 ng·h/ml和2567.88±1054.25 ng·h/ml,高脂餐组比空腹组显著增大(p=0.000);AUC0-∞分别为1952.99±659.12 ng·h/ml和2638.95±1143.97 ng·h/ml,高脂餐组也显著大于空腹组(P=0.002);T1/3Ka和T1/2Ke在空腹组和高脂餐组中分别为2.03±1.58 h、4.92±4.01 h和9.89±5.36 h、11.53±6.72 h,两组之间的半衰期无显著性差异(P=0.106;P=0.704):Cmax和Tmax在两组中分别为143.30±53.39 ng/ml、291.10Q90.44 ng/ml和4.14±2.26 h、5.28±2.99 h,高脂餐组的峰浓度显著大于空腹组(P=0.000),达峰时间在高脂餐组中有延长趋势,但无统计学意义(P=0.06)。
结论：⑴口服硝苯地平后不同CYP3A5基因型曲线下面积不同,提示临床上在使用硝苯地平治疗时可依据CYP3A5基因分型来进行个体化给药。⑵高脂饮食能够增加硝苯地平的吸收程度,临床上在使用硝苯地平时,应充分考虑病人的饮食习惯,建议尽量清淡饮食。