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研究背景:胃癌(GC)是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一。大多数的胃癌患者死亡是由于癌细胞的侵袭和转移所致。然而,胃癌细胞侵袭和转移发生的根本仍不十分清楚,因此,进一步阐明胃癌侵袭和转移的分子机制对改善疗效和延长晚期胃癌患者的生存期很有必要。微小RNA是在肿瘤发展和癌变过程中参与基因表达转录后调节的小分子非编码RNA。诸多研究表明,微小RNA可以影响胃癌细胞的侵袭、迁移和增殖的能力。MiR-145-5p已经在多种癌症中作为抑癌基因被报道,如结肠癌、乳癌、前列腺癌。此外,先前的研究已经表明,MiR-145-5p作为抑癌基因,在胃癌中的表达是下调的。然而,MiR-145-5p抑制胃癌的分子机制,特别是通过EMT抑制胃癌细胞侵袭、迁移等机制尚未见报道。EMT的概念是Greenburg和Hay在1982年提出的,是指在许多因素的影响下致使上皮细胞间失去极性连接和获得间质细胞的表型,然后细胞获得迁移的能力。在EMT过程中,下调粘附分子如E-cadherin或上调间质分子如N-cadherin可降低上皮细胞-细胞粘连和促进癌细胞的侵袭和迁移。所以,MiR-145-5p和其下游的EMT的信号通路相关蛋白可作为胃癌预防和治疗的新靶标。 目的:检测miR-145-5p在人类胃癌细胞株(SGC-7901、MKN-45、BGC-823、AGS)、人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1及人胃癌组织中的表达,探讨miR-145-5p通过EMT过程对人胃癌细胞SGC-7901及AGS侵袭和迁移产生影响的机制。 方法:按照TRIzol试剂提取60对新鲜胃癌组织及其相对应的癌旁正常黏膜组织的总RNA(具体操作步骤见说明书),同样的方法提取人胃癌细胞株(SGC-7901、MKN-45、BGC-823、AGS)及人正常胃黏膜上皮细胞株(GES-1)的总RNA,然后使用cDNA逆转录合成试剂盒(SuperscriptⅢ cDNA synthesis kit)说明书上的操作步骤合成cDNA,应用RT-PCR方法检测miR-145-5p的表达水平。 为研究miR-145-5p对胃癌细胞侵袭、迁移能力的影响,我们使用6孔培养板进行细胞铺板,培养。按Lipofectamine2000说明书将miR-145-5p inhibitor及阴性对照inhibitor negative control转染入SGC-7901,将miR-145-5p mimic及阴性对照mimic negative control转染入AGS;转染24h后,行transwell实验,检测细胞迁移、侵袭能力的变化。 通过PCR验证,miRBase Targets,TargetScan Release5.0,and PicTardatabases所预测的miR-145-5p的靶基因随miR-145-5p表达水平的变化。 通过PCR、WB进一步验证miR-145-5p对EMT相关靶基因及标志物的影响。 通过SPSS软件统计miR-145-5p在60对胃癌组织中的表达及与临床病理指标的关系。 结果: 1).PCR结果显示:miR-145-5p在76.7%(46/60)的胃癌组织中低表达。人胃癌细胞株MKN-45、SGC-7901、BGC-823和AGS中miR-145-5p的表达水平低于其在人胃黏膜上皮细胞株GES-1中的表达,其表达水平为GES-1>SGC-7901>BGC-823>MKN-45>AGS。 2).miR-145-5p inhibitor促进SGC-7901细胞的迁移、侵袭活性;miR-145-5p mimic抑制AGS细胞的迁移、侵袭活性。 3).PCR证实在转染成功的AGS和SGC-7901细胞中,miR-145-5p的变化与靶基因ZEB2、N-cadherin之间的变化有意义,而与其他靶基因如IRS-1、FSCN1、C-Myc、Ets-1之间的变化无意义。 4).PCR和WB证实miR-145-5p抑制靶基因ZEB2、N-cadherin的表达,促进E-cadherin的表达,从而证实miR-145-5p通过抑制靶基因N-cadherin和ZEB2的表达来抑制上皮间质转化过程从而影响胃癌细胞的侵袭能力。 5).miR-145-5p的表达与胃癌的肿瘤浸润深度、淋巴管侵犯、淋巴结转移、Lauren分型和TNM分期密切相关,而与肿瘤大小、年龄、性别、血管侵犯、神经侵犯及远处转移无关。 结论:miR-145-5p通过靶向作用N-cadherin和ZEB2抑制上皮间质转化从而抑制胃癌侵袭性。MiR-145-5p的表达与胃癌的Lauren分型、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、淋巴管侵犯和TNM分期密切相关。