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多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一类新型的溴系阻燃剂,广泛应用于电子产品、涂料和各种纺织品中。由于PBDEs具有难降解性、稳定性、高脂溶性和生物放大作用,能够通过食物链的转移,使处于高位营养级的生物受到毒害,最终导致对人体的神经、内分泌、生殖系统造成危害。近年环境中PBDEs的浓度不断上升且已在世界各地普遍存在,又因PBDEs的化学结构与多氯联苯(Polychorinated biphenyls, PCB)和滴滴涕(2,2-bis(4-Chlorophenyl)-1,1,1-trichloroethane, DDT)非常相似,因此PBDEs的环境毒性越来越受到学者们的关注。菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)是我国沿海重要的滩涂贝类。本论文以菲律宾蛤仔为研究对象,分别从分子生物学和酶学水平全面系统的研究了BDE-47对菲律宾蛤仔相关解毒代谢酶基因,解毒代谢酶活力及DNA损伤的影响,初步探讨了BDE-47在菲律宾蛤仔体内的毒性效应过程。1菲律宾蛤仔细胞色素P450 (CYP4)基因的克隆、序列分析及组织特异性本研究通过相近物种CYP4氨基酸序列的同源性比对,根据保守氨基酸序列设计兼并引物,成功调取CYP4的核心片段426 bp。根据已知片段分别设计扩增3’和5’核酸序列的特异性引物,利用改良的TDT末端加尾法和RACE技术成功克隆了菲律宾蛤仔CYP4基因的完整cDNA序列。菲律宾蛤仔CYP4基因全长2107 bp,开放性阅读框(open reading frame, ORF)长1329bp,编码442个氨基酸。将菲律宾蛤仔CYP4的氨基酸序列与其它物种的CYP4氨基酸序列进行同源性比较发现,CYP4具有较高的保守性。通过RT-PCR技术研究发现,CYP4基因只在菲律宾蛤仔鳃,消化盲囊及闭壳肌中表达,而外套膜和足中没有表达。2菲律宾蛤仔谷胱甘肽硫转移酶(GST-pi)基因的克隆、序列分析及组织特异性本研究通过相近物种GST氨基酸序列的同源性比对,根据保守氨基酸序列设计兼并引物,利用RT-PCR成功调取GST的核心片段309 bp。根据已知片段分别设计扩增3’和5’核酸序列的特异性引物,利用改良的TDT末端加尾法和RACE技术成功克隆了菲律宾蛤仔GST基因的完整cDNA序列。菲律宾蛤仔GST全长1142 bp,包括618 bp的ORF,并编码205个氨基酸。将菲律宾蛤仔GST的氨基酸序列通过NCBI进行过BLAST后发现,菲律宾蛤仔GST基因隶属于pi亚族,且具有较高的保守性,其中和栉孔扇贝(Chlamys Farreri)的相似性高达91%。通过RT-PCR技术研究发现,GST-pi基因在菲律宾蛤仔鳃、消化盲囊、闭壳肌、外套膜和足中均有表达,且消化盲囊中的表达量相对较低。3 BDE-47对菲律宾蛤仔鳃及消化盲囊中解毒代谢酶基因表达的影响本实验将菲律宾蛤仔暴露于不同浓度(0,0.25μg/L和6.25μg/L)的BDE-47,并于0 d,1 d,3 d,6 d,10 d,15 d,21 d分别取鳃和消化盲囊组织,提取总RNA后通过半定量RT-PCR技术分析两组织中AhR, CYP4, GST-pi和PgP基因表达量的变化。结果表明,BDE-47对菲律宾蛤仔鳃和消化盲囊AhR, CYP4, GST-pi和PgP基因表达量变化影响显著(P<0.05),而对照组无明显变化。菲律宾蛤仔鳃组织中的AhR基因暴露于不同浓度的BDE-47后呈明显的峰值变化,而消化盲囊组织中AhR基因在低浓度处理条件下被显著诱导升高,高浓度处理条件下则直接被抑制,这与两组织中GST-pi基因的变化趋势基本类似。0.25μg/L BDE-47处理组鳃组织中PgP基因于1d时被显著诱导升高并保持稳定,而6.25μg/L处理组PgP基因则呈明显的峰值变化,消化盲囊中PgP基因在低浓度处理组呈持续升高状态,而在高浓度组于1d时被显著诱导升高后不断降低,最终低于对照组水平,但差异不显著(P>0.05)。本研究表明,BDE-47可以通过影响相关解毒代谢基因表达量的变化而影响其在菲律宾蛤仔体内的代谢过程。4 BDE-47对菲律宾蛤仔组织解毒代谢酶活力与DNA损伤的影响研究了不同浓度(0,0.05,0.25,1.25和6.25μg/L) BDE-47对菲律宾蛤仔鳃和消化盲囊芳烃羟化酶(AHH)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和还原型谷胱甘肽(GSH)含量、DNA损伤(F值)的影响。结果表明：BDE-47对菲律宾蛤仔鳃和消化盲囊AHH、GST、SOD活力和GSH含量、F值影响显著(P<0.05),而对照组无明显变化。在实验时间内,除0.01μg/L BDE-47处理组鳃丝AHH活力与对照组无明显差异外,其它处理组组织AHH活力表现为显著的诱导作用,且在15d内呈峰值变化,15d后趋于稳定；低浓度(0.01,0.05和0.25μg/L)处理组组织GST、SOD活力和GSH含量均呈现先升高后下降的趋势,分别于3d或1d达到最大值,10 d后保持稳定,表现为恢复至对照组水平或被诱导和抑制,而高浓度(1.25和6.25μg/L)处理组则呈逐渐下降趋势,均被显著抑制,至10d或15d后变化平稳。除0.01μg/L处理组外,各染毒处理组组织F值均被显著抑制,呈明显下降或峰值变化,至15 d后均保持稳定。同时各处理组组织AHH、GST、SOD活力和GSH含量、F值在稳定后分别与BDE-47浓度呈显著的正、负相关性(P<0.05)。由此表明,在BDE-47染毒作用下菲律宾蛤仔组织解毒代谢指标和DNA损伤表现出明显的时间、剂量效应性,经相关性分析提出菲律宾蛤仔鳃、消化盲囊SOD活力和组织DNA损伤可作为BDE-47污染评价的生物标志物。