【背景】严重烧、创伤往往伴有深部软组织和骨组织缺损,由于缺损组织多、面积大,传统“拆东墙补西墙”的修复方式一般无法修复。异体复合组织(VCA),由于取自尸体相同部位的组织,可避免以上不足,达到比较满意的修复外形,甚至恢复部分功能,有望成为此类缺损的理想修复手段。自1998年首例手移植和2005首例脸移植成功以来,全球已进行超过100例手移植和30多例脸移植手术,取得了较好的外观和功能修复结果,鼓舞着后来人对异体复合组织移植的探索。然而,复合组织移植面临的主要问题是排斥和终身服用免疫抑制药物,这对“life-saving”的器官移植可以接受,但对“life-changing”的复合组织移植无疑不可取,限制了其应用和推广。所以,如何减少或避免免疫抑制剂的使用成为异体复合组织移植能否进一步发展的关键。骨髓细胞移植具有免疫耐受诱导作用,相关机制也得到大量研究。目前已有成功诱导临床肾耐受的报道,先后在三个中心获得成功,术后无需服用免疫抑制剂即可长期存活,而且无排斥反应发生。某些复合组织,如脸移植和手移植,本身包含血管化的骨瓣,具有骨髓和骨髓微环境,有可能作为一种更加高效的骨髓移植方式。既然移植骨髓无需经历骨髓加工、分离和归巢等过程,在其原有微环境即可增殖分化,为受体持续供应供体细胞,从而促进耐受形成。业已证实,后肢在清髓性预处理条件下可自我诱导耐受,灵长类动物的脸移植也因附带骨瓣而使存活时间延长。所以,针对复合组织含血管化骨髓这一特性,本实验拟研究这一特殊骨髓移植方式的致耐受潜能,从而试图为复合组织致耐受,也为器官移植致耐受,开辟一个新的途径。为此,首先有必要构建一个合适的带血管骨髓移植模型。传统的模型多以大鼠后肢为移植模型,它模拟了临床手移植,既有利于研究移植物的免疫学特性,还可评估术后功能恢复情况。然而,该模型手术操作复杂,涉及截骨和髓内固定,受体创伤大、死亡率和并发症高。既然,我们的研究主要关注于复合组织的免疫学特性,即血管化骨髓,而对功能要求不高。因此,我们拟替代后肢,构建一个组织成分与之类似,但操作更为简便的模型,从而有利于血管化骨髓的研究。血管化骨髓不仅包含造血干细胞,还包括内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和成骨细胞等基质细胞,他们对移植骨髓细胞功能的发挥至关重要。大量研究证实,骨髓细胞联合成骨细胞、间充质干细胞甚至去骨髓的骨瓣等均可促进骨髓植入,有利于清髓受体的造血重建及耐受诱导。那么这种带血管的骨髓移植是否也像静脉骨髓移植一样具有造血能力?能否作为一种高效的骨髓移植方式?这都是需要研究回答的问题。研究血管化骨髓的最终目的是耐受,所以我们拟在非清髓性免疫诱导方案作用下,探索血管化骨髓的致耐受潜能。通常,骨髓诱导耐受有赖于受体去t细胞治疗、胸腺照射和清髓性预处理,三者缺一不可,其中前两者是为克服外周血和胸腺内的排斥反应,而后者是为移植骨髓“腾出空间”,提高骨髓细胞的植入率。这也是现有免疫诱导方案的基本组成部分,然而该方案涉及全身清髓,易导致骨髓抑制、三系细胞减少等并发症,不适于复合组织移植。血管化骨髓同时包含骨髓和微环境,即自带“生存空间”,可能无需“腾空间”的全身清髓即可诱导耐受。所以,我们拟设计了一个低毒、无清髓的诱导方案,并基于此方案来阐明血管化骨髓的致耐受作用。【目的】1)构建一个简便、可靠的带血管骨髓移植模型;2)探索带血管骨髓的造血重建潜能,并与传统的静脉骨髓移植进行比较,观察其可否作为一种有效的骨髓移植方式;3)探索复合组织移植中血管化骨髓对其存活的影响,并对相关的致耐受机制进行研究。【方法】1)模型构建:以股骨作为骨髓载体,在同基因的lewis大鼠间将含腹股沟皮瓣和部分股骨的骨肌皮瓣移植到受体腹股沟区,显微吻合供受体间的营养血管即股动静脉。术前通过解剖学研究,确定移植物的营养血管和基本手术步骤;术中通过美兰灌注,观察营养血管的供血分布情况;术后从组织病理学角度分析移植物的活性,验证该模型的可行性;最后改进实验模型,衍生多个不同的带血管骨髓移植模型,为后续不同实验的开展提供模型工具。2)带血管骨髓的造血潜能评估-1:以上部分实验构建的股骨移植模型为骨髓载体,将gfp大鼠股骨移植给经5gy放射清髓的lewis大鼠,术后给予环孢菌素a抑制排斥和gvhd(移植物抗宿主疾病),然后通过血常规、脾指数测定、骨髓细胞计数和组织病理等方法评估受体的造血恢复情况,并用流式、荧光显微镜等方法分析细胞来源。所得结果与静脉骨髓移植组(静注与股骨等量的骨髓细胞,阳性对照)和假手术组(阴性对照)进行比较,评估血管化骨髓的造血潜能。3)带血管骨髓的造血潜能评估-2:为避免因排斥和供体基因不纯而引起的实验误差,类似实验在同基因lewis大鼠中进行重复,再次评估带血管骨髓、静脉骨髓细胞悬液和假手术组的造血重建情况。4)带血管骨髓致耐受性评估:以mhc完全不相符的近交系lewis和bn大鼠作为移植供受体,所有大鼠行腹股沟皮瓣移植,同时分别联合股骨移植(vbmt组)、静脉骨髓移植(i.v.bmt组)和生理盐水注射(control组),并给予抗淋巴细胞血清、胸腺照射和环孢菌素a进行免疫诱导。术后对比各组皮瓣的存活时间和外周血、组织中供体特异性嵌合水平,并通过组织病理学方法评估各组皮瓣的排斥程度,组织切片和流式分析移植股骨的活性和组织来源,探索其致耐受的可能机制。【结果】1)(1)股骨移植平均手术时间(159.0±8.3)min,其中供体剥离时间(68.0±4.8)min,缺血时间(55.8±6.8)min;(2)美兰灌注显示股动静脉可以保证股骨和皮瓣的血供,模型具有一定的可行性;(3)所有10个移植物长期存活,无一例坏死,皮瓣外观红润,有毛发生长;(4)皮肤和股骨的he染色结果基本正常,证实了模型的可行性;(5)在此模型基础上进一步发展了含皮瓣的全股骨移植模型和不含皮瓣的全股骨移植模型。2)(1)与假手术对照组相比,带血管骨髓和静注的骨髓细胞悬液都显著加速了清髓大鼠白细胞和血小板的恢复(p<0.05),且恢复细胞主要来自gfp供体而非受体;(2)带血管骨髓促进了脾集落的形成,脾脏指数高于假手术组(p<0.05),脾脏he染色虽未见结构清晰的白髓,但可见大量淋巴小结和淋巴细胞,而假手术组脾内细胞成分明显减少;(3)同样,带血管骨髓移植组受体骨髓he染色也可见稀疏的骨髓细胞,而对照组骨髓基本被空泡性组织所取代;单根胫骨骨髓细胞数也较对照组高一个数量级(p<0.05);且骨髓流式和骨髓涂片显示90%以上为gfp+,提示移植骨髓重建受体的造血系统。(4)移植后15d切除移植股骨,恢复的白细胞和血小板再次减少,进一步验证了vbm在早期受体造血重建中的关键作用;(5)然而,以上各项指标,除第5d时vbmt组血小板数高于i.v.bmt组外,其余指标vbmt和i.v.bmt均无明显差异,甚至在骨髓重建上vbmt还稍慢于i.v.bmt;(6)血管化骨髓的同基因移植所得结果与上述结果类似,再次验证了vbmt的造血潜能。3)(1)通过抗淋巴细胞血清、胸腺照射和环孢素a联合诱导,可以有效的清除受体外周血t细胞和淋巴细胞,为耐受诱导提供了条件;(2)在此诱导方案作用下,带血管骨髓显著延长皮瓣存活到78.8±13.0d,而静脉骨髓组和对照组分别在60.4±1.7d和58.6±1.3d发生排斥;(3)带血管骨髓诱导了稳定的外周血嵌合,约5.81%±1.98%,至75d时消失,而另两组整个观察期几乎无嵌合形成;(4)带血管骨髓促进供体细胞定植到受体脾、骨髓、淋巴结,但胸腺无供体定植;(5)移植股骨所含骨髓细胞逐渐被受体细胞所取代,不能持续为受体供应供体细胞;(6)移植股骨内骨髓可能与皮瓣同时发生排斥或先于皮瓣,且最终纤维化。【结论】我们的研究有几个重要发现:1)通过股骨移植,我们成功构建了多个简便、可靠的带血管骨髓移植模型,为复合组织移植中血管化骨髓的研究提供了模型基础;2)证实了血管化骨髓的造血作用,可以作为一种有效的骨髓移植方式,为血管化骨髓的致耐受研究提供了理论依据;3)在非清髓性免疫诱导方案下,发现复合组织中血管化骨髓可以延长复合组织的存活时间,并诱导稳定的嵌合;4)发现血管化骨髓不能源源不断为受体提供供体细胞,且最终被受体细胞所取代。总之,以上研究证实了异体复合组织中血管化骨髓的免疫保护作用,为复合组织免疫耐受的诱导提供了一个新的途径。