背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,在所有恶性肿瘤中,其发病率位列第5位,死亡率居第2位。我国是肝癌大国,全世界有50%左右的HCC患者在中国。目前,手术切除仍是HCC最有效的治愈性治疗措施之一,但术后五年复发转移率可高达70%以上。HCC的高侵袭转移潜能是其术后复发转移及预后不良的重要原因,而侵袭性伪足（Invadopodia）的形成是决定肝癌细胞高侵袭潜能的关键生物学事件之一。侵袭性伪足是肿瘤细胞膜上的一种手指状膜突起性结构,主要由缺氧、生长因子、外泌体、基质硬度等因素诱导形成,具有降解细胞外基质的作用。在肿瘤侵袭转移过程中,侵袭性伪足伸入细胞外基质,并在伪足顶端的细胞膜上招募、分泌MMP14、MMP2、MMP9等基质金属蛋白酶,降解细胞外基质,从而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。研究表明,侵袭性伪足的形成是HCC侵袭转移的关键起始步骤,但其形成的调控机制尚不明确。Ezrin是ERM（Ezrin/Radixin/Moesin）细胞骨架连接蛋白家族成员之一,在细胞微绒毛结构的形成、细胞极性的维持、细胞黏附、细胞迁移及信号转导等方面发挥重要的生理作用。已有研究表明,Ezrin在肝细胞癌中高表达,且与肝细胞癌的侵袭转移潜能及不良预后呈正相关。既往关于Ezrin调控HCC侵袭转移的机制研究主要侧重于细胞信号转导、糖代谢重编程以及上皮间质转分化等方面,但其是否通过调控肝癌细胞侵袭性伪足的形成进而促进肝癌侵袭转移目前尚未见报道。本课题拟通过生信分析、临床标本检测、细胞及动物实验等研究,明确Ezrin对肝癌细胞侵袭性伪足形成的调控作用,为HCC侵袭转移的防治提供潜在干预靶点。目的1.通过生物信息学分析Ezrin分子功能与侵袭性伪足形成是否具有相关性;并分析肝癌组织中Ezrin与侵袭性伪足标志物Cortactin、TKS5、MMP14在m RNA表达水平上的相关性。在HCC组织芯片上检测Ezrin与侵袭性伪足标志物的蛋白表达水平,分析Ezrin与侵袭性伪足标志物在蛋白表达水平上的相关性;收集并整理HCC患者的临床病理资料及随访结果,并分析Ezrin的表达水平与肝癌患者临床病理参数及预后的关系,明确Ezrin及侵袭性伪足标志物在HCC侵袭转移中的作用及对患者预后的影响。2.在细胞水平上,探讨Ezrin对肝癌细胞侵袭性伪足的形成及伪足明胶降解功能的影响,明确Ezrin不仅可以在结构上调控肝癌细胞侵袭性伪足的形成,还可在功能上调节侵袭性伪足的明胶降解活性,验证Ezrin通过诱导伪足形成促进肝癌细胞的侵袭及迁移。3.构建裸鼠肝脏移植癌模型,在体内验证Ezrin对肝癌细胞侵袭性伪足的调控作用。方法1.通过在线生信网站对Ezrin功能结合蛋白进行富集分析,并对Ezrin与侵袭性伪足标志物Cortactin、TKS5、MMP14在HCC组织m RNA表达水平上的相关性进行分析。收集并筛选105例2010年1月-2012年12月在我院行手术切除治疗且术后病理证实为肝细胞癌患者的病例资料。记录患者的肿瘤大小、TNM分期、病理分化程度等临床病理资料及术后随访结果。切除的肝癌组织以石蜡包埋的形式储存于标本库中,标本取出后制成组织芯片。免疫组化检测105例肝癌组织中Ezrin及侵袭性伪足标志物Cortactin、TKS5、MMP14的表达水平,并对Ezrin蛋白与侵袭性伪足标志物在肝癌组织中的表达进行相关性分析;分析Ezrin的表达与HCC患者临床病理参数及预后的关系。2.体外培养高侵袭潜能的Huh7细胞及低侵袭潜能的PLC/PRF/5细胞,采用慢病毒转染技术分别在这两种细胞中上调和下调Ezrin的表达。细胞划痕实验和Transwell实验检测Huh7和PLC/PRF/5细胞的侵袭及迁移能力变化。Western Blot检测Huh7和PLC/PRF/5细胞中Ezrin及侵袭性伪足相关标志物Cortactin、Tks5、MMP14的表达水平变化。细胞免疫荧光及明胶降解实验分别观察Huh7及PLC/PRF/5细胞中侵袭性伪足的形成及明胶降解能力变化。3.体外构建Ezrin稳定低表达的Huh7细胞和稳定高表达的PLC/PRF/5细胞,将构建好的稳转株细胞接种在裸鼠肝脏包膜下,建立裸鼠肝脏原位移植癌模型。4周后,处死裸鼠,取出病肝组织,统计病肝肿瘤转移灶数量,并制作石蜡连续切片,对切片做HE染色及免疫组化染色检测Ezrin及侵袭性伪足标志物Cortactin、Tks5、MMP14在裸鼠肝癌组织中的表达。结果1.通过STRING数据库筛选出20种可与Ezrin发生功能结合的蛋白,富集分析发现Ezrin功能结合蛋白在板状伪足、丝状伪足、足体等伪足结构中分布,参与足体装配及形态发生、细胞骨架重塑等与侵袭性伪足形成密切相关的生物学过程,并在Rho、ERK1/2、TGFβ等侵袭性伪足上游调控通路中发挥作用。GEPIA数据库基因表达相关性分析表明肝癌组织中Ezrin与侵袭性伪足标志物Cortactin、Tks5、MMP14在m RNA的表达水平上均呈正相关。肝癌组织芯片免疫组化结果显示Ezrin与侵袭性伪足标志物Cortactin、Tks5、MMP14在蛋白表达水平上也均呈正相关。病例研究提示Ezrin高表达组肝癌患者相较低表达组的血管侵犯率（P=0.0157）及肿瘤相关死亡率（P=0.0179）均明显增高。Ezrin高表达组患者术后五年总体生存率（P＜0.0001）及无瘤生存率（P=0.0038）均显著低于Ezrin低表达组。2.细胞划痕实验及Transwell实验证实上调Ezrin蛋白的表达可促进肝癌细胞的迁移及侵袭,下调Ezrin蛋白表达可抑制肝癌细胞的迁移及侵袭。Western blot半定量分析结果表明,在肝癌细胞中过表达Ezrin,侵袭性伪足标志物Cortactin、Tks5、MMP14的表达均上调;在肝癌细胞中敲低Ezrin,侵袭性伪足标志物Cortactin、Tks5、MMP14的表达均下调。细胞免疫荧光双染实验证实,Ezrin表达上调可在结构上促进肝癌细胞侵袭性伪足的形成,具体表现为出现Cortactin与F-actin共定位斑点的细胞明显增多;Ezrin表达下调时出现Cortactin与F-actin共定位斑点的细胞显著减少。荧光明胶降解实验发现,Ezrin高表达可在功能上增强侵袭性伪足对明胶基质的降解活性,表现为每个细胞上F-actin与黑色的明胶降解区域共定位的斑点增多,即平均每个细胞的活性侵袭性伪足数量增多;反之,干扰Ezrin的表达会在功能上减弱侵袭性伪足对明胶基质的降解活性,即平均每个细胞的活性侵袭性伪足数量减少。3.Ezrin稳定低表达的Huh7细胞与其对照组细胞相比,其在裸鼠肝脏内的肿瘤转移病灶数量明显减少;Ezrin稳定高表达的PLC/PRF/5细胞与其对照组细胞相比,其在裸鼠肝脏内的肿瘤转移病灶数量明显增多。HE染色及免疫组化结果提示Ezrin与侵袭性伪足的三种标志物Cortactin、Tks5、MMP14的表达均呈正相关。结论1.Ezrin的分子功能与侵袭性伪足密切相关;肝癌组织中Ezrin与侵袭性伪足标志物Cortactin、Tks5、MMP14的m RNA表达水平及蛋白表达水平均呈正相关;Ezrin与HCC的血管侵犯等恶性表型及不良预后呈正相关。2.Ezrin不仅可在形态上调控肝癌细胞侵袭性伪足的形成,还可在功能上调节侵袭性伪足的明胶降解活性,进而促进肝癌细胞的侵袭及迁移。3.Ezrin可促进裸鼠肝脏原位移植癌的侵袭转移,其机制可能是通过调控肝癌细胞侵袭性伪足的形成。综合生信分析、病例研究、细胞实验、动物实验四个方面的研究,我们得出如下结论:Ezrin可通过调控肝癌细胞侵袭性伪足的形成及明胶降解功能在体内外促进HCC的侵袭转移。但Ezrin调控肝癌细胞侵袭性伪足的形成及功能的具体机制,我们尚缺乏深入研究,这将是我们后续研究工作的重点。