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目的 人非肌肉肌球蛋白轻链激酶(hnmMLCK)N端表达载体的构建及其体外表达，表达产物的纯化及多克隆抗体的制备。用MLCK特异性抑制剂ML-9处理人膀胱癌细胞系ScaBer，观察hnmMLCK在细胞增殖中的作用 方法 用PCR方法扩增hnmMLCK的N端cDNA，扩增产物与T-Vector连接，构建克隆载休pGEM-hnmMLCK。在宿主菌中扩增重组质粒，提取质粒并进行酶切纯化，将目的基因插入pBKcmv中构建成表达载体，再次转化入大肠杆菌XL1-blue，蓝白选择、耐药性标记粗筛并挑取阳性克隆，经限制性内切酶酶谱分析、DNA序列分析两种方法鉴定。用IPTG诱导表达。SDS-PAGE，割下所需条带，用电洗脱方法纯化得到所需目的蛋白。免疫新西兰纯种大白兔，制备多抗，并用免疫双扩散法测定抗体效价。用不同浓度(0～60μM)MLCK特异性抑制剂ML-9处理人膀胱痛细胞系ScaBer，用酸性磷酸酶法测定细胞增殖受到的影响；用兔抗hnmMLCK抗体为一抗，驴抗兔IgG(异硫氰酸荧光素)为二抗，对不同浓度ML-9处理的细胞进行荧光分析，观察MLCK表达情况以及细胞的形态变化。提取细胞的基因组DNA，观察细胞是否出现凋亡 结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为pBKcmv-hnmMLCK重组质粒，SDS-PAGE证实获得的融合蛋白分子虽为21kD，表达量约占菌体总蛋白的21％。所得多抗效价为1：16。细胞在ML-9浓度大于10μM时，增殖受到显著抑制(P＜0.01)：细胞形态发生变化。在ML-9浓度大于30μM时，MLCK表达最明显增强。但是细胞末发生凋亡 结论 成功构建重组hnmMLCK表达载体，并在大肠杆菌中获得表达，并获得hnmMLCK的多克隆抗体。MLCK特异性抑制剂ML-9显著抑制膀胱癌细胞增殖，且MLCK的表达增加。但不诱导细胞凋亡