雷公藤具有清热解毒、祛风通络等作用,临床上广泛用于风湿免疫疾病的治疗,但其具有明显肝毒性,而雷公藤甲素(TP)作为其活性最高的环氧化二萜内酯化合物,不仅是其主要活性成分,也是引起毒副作用的主要成分。本课题从核受体-代谢酶角度研究TP肝毒性机制,并在此基础上进一步探讨雷公藤复方组分配伍调控核受体CAR-代谢酶减轻TP肝毒性的作用及机制。第一章:核受体CAR在TP肝毒性中的作用研究体内实验:雌性SD大鼠根据体重随机分为正常对照组,溶媒对照组(0.5%CMC-Na),TP低、中、高剂量组(0.3mg/kg,0.6mg/kg,1.2mg/kg),灌胃给药7天后检测血清中AST、ALT、LDH含量:HE染色观察肝组织病理改变;Real-time PCR方法检测大鼠肝组织中核受体CAR mRNA的表达。结果显示:不同剂量TP组大鼠血清ALT、AST、LDH含量较对照组增加,以高剂量组最为显著;肝组织出现脂肪变性,炎细胞浸润,血窦充血等病理学改变;肝组织中CAR mRNA表达受到明显抑制(P<0.05)。体外实验:用不同浓度的 TP(0.0004 mg/mL、0.004 mg/mL、0.04 mg/mL、0.4 mg/mL)分别作用于HepG2细胞,检测细胞活力及上清中AST、ALT、LDH的含量;Real-time PCR检测 HepG2 细胞中 CAR、CYP3A4、CYP2C9 及 UGT1A6 mRNA 的表达;FAM-siRNA瞬时转染HepG2细胞,倒置荧光显微镜下观察荧光现象,筛选最佳转染条件;Real-time PCR检测转染后细胞中CAR mRNA的表达,筛选、确定转染核受体CAR的细胞模型;比较NC-siRNA组与CAR敲减组分别给予TP(0.04mg/mL)后,细胞上清中ALT、AST及细胞中代谢酶的表达。结果显示,不同剂量TP均可以降低细胞活力,影响细胞形态,增加细胞上清中ALT、AST、LDH的含量,诱导CAR及其下游代谢酶CYP3A4、CYP2C9 mRNA的表达;CAR敲减+TP组中AST、ALT含量显著增加(P<0.05),代谢酶 CYP3A4、CYP2C9、UGT1A6 mRNA 的表达显著降低(P<0.05)。结论:体内外实验表明,一定剂量范围的TP可导致明显肝毒性;CAR敲减可引起TP毒性增加,代谢酶表达异常,说明TP肝毒性机制与核受体CAR-代谢酶异常表达有关。第二章:雷公藤复方组分配伍调控核受体CAR-代谢酶减轻肝毒性的作用及机制研究体内实验:雌性SD大鼠随机分为正常对照组、溶媒对照组(0.5%CMC-Na)、TP组(1.20mg/kg)、TP+三七总皂苷(PNS 1.20g/kg)、TP+梓醇(CAT 0.24g/kg),灌胃给药 7天后检测血清中ALP、ALT、AST、LDH等含量;Real-time PCR检测肝组织中CAR mRNA的表达。结果显示:与TP组比较,雷公藤组分配伍组大鼠血清中ALT、AST、LDH、ALP水平降低减轻了 TP的肝毒性;肝组织中CAR mRNA表达显著增加(P<0.05)。体外实验:采用MTT法筛选不同浓度PNS、CAT分别配伍TP(0.04mg/mL)的最佳减毒浓度,检测肝细胞中CAR mRNA的表达,瞬时转染CAR-siRNA后,Real-timePCR法验证CAR的转染效率,构建CAR瞬时敲减的细胞模型;将PNS(5μg/mL)、CAT(2μg/mL)配伍TP(0.04mg/mL)加入到瞬时敲减的细胞模型中,检测AST、ALT的含量及代谢酶CYP3A4、CYP2C9及UGT1A6的表达。结果表明,TP可显著诱导CYP3A4、CYP2C9 mRNA的表达,PNS、CAT配伍TP后均可进一步显著增加CYP3A4、CYP2C9 mRNA的表达,CAT配伍TP对UGT1A6 mRNA的表达也具有显著诱导作用;CAR瞬时敲减后,雷公藤复方组分配伍可降低AST、ALT含量,提高SOD、GSH的含量,显著提高CYP3A4,CYP2C9 及 UGT1A6 的表达。结论:雷公藤复方组分配伍可诱导CAR的表达,调控代谢酶的转录,抑制脂质过氧化反应,调节氧化应激状态,减轻肝毒性,调控核受体-代谢酶是复方组分配伍减毒的重要机制之一。