论文部分内容阅读
第一部分Fe3O4纳米粒的合成与修饰目的：①通过对Fe3O4纳米粒的合成方法进行优化及包裹修饰,增加Fe304纳米粒在电解质溶液中的稳定性、分散性及生物相容性；②检测Fe304纳米粒在肿瘤细胞中的摄取作用及细胞毒性,为其后续研究打下基础。方法：①应用热分解法制备Fe3O4纳米粒,分别对其进行TiO2, DSPE-mpeg, PAA包裹修饰；②应用粒度仪检测其水合粒径大小及分散性,透射电子显微镜检测其粒径及分布,XRD测定其元素及构型,VSM测定其磁性特征；③对纳米粒进行荧光修饰,通过细胞摄取实验,应用共聚焦显微镜检测其在细胞中的分布,并通过光镜及透射电子显微镜印证纳米粒在细胞中的分布。④红外温度计测定不同浓度下Fe3O4@PAA纳米粒在交变磁场下的升温情况,明确其产热作用；⑤将梯度浓度的Fe3O4@PAA纳米粒与肿瘤细胞共同孵育24h,检测细胞内摄取的纳米粒的质量。⑥纳米粒鼠尾静脉注射H22鼠源性肝癌移植瘤模型,HE染色观察小鼠主要器官中纳米粒的分布；⑦应用MTT法检测其对肿瘤细胞的毒性。结果：①XRD显示应用热分解法制备的Fe3O4纳米粒高度和位置与JCPDS(粉末衍射标准联合会)数据库卡片(JCPDS19-0629)中的Fe304磁性纳米粒子结果一致。其粒径为8-10nm,VSM测得饱和磁化强度为18emu/g。分别进行修饰后Fe304@TiO2、 Fe3O4@DSPE-mpeg、Fe3O4@PAA粒径分别为：260nm,120nm,68nm;三者饱和磁化强度分别为：12emu/g,42emu/g,12emu/g;根据上述结果选择Fe3O4@PAA纳米粒作为进一步实验的材料。②光镜、共聚焦显微镜及透射电子显微镜均可观察到Fe3O4@PAA纳米粒在细胞质中分布。③纳米粒在500kHZ交变磁场下,随着时间的延长,浓度越高,温度升高的越快,30mmin内温度升高较快,之后升高速度明显变慢。④随着纳米粒浓度的升高,细胞内摄取的纳米粒并不随之升高,细胞内摄取的纳米粒约为20ug。⑤成功建立了H22鼠源性肝癌动物模型,鼠尾静脉注射纳米粒后其主要分布在肿瘤组织中,脾脏中也发现有纳米粒,肺脏、肝脏组织中均未发现纳米粒。⑥MTT法实验结果显示Fe3O4@PAA纳米粒在50-800ug/ml浓度范围内对大细胞肺癌细胞H460,鼻咽癌细胞CNE-2、HNE-1均无明显抑制作用。结论：①本实验应用热分解法成功制备了Fe3O4纳米粒,并成功对其进行了修饰：Fe3O4@TiO2、Fe3O4@DSPE-mpeg、Fe3O4@PAA,通过检测,证明Fe3O4@PAA纳米材料在粒径、分散性、稳定性、超顺磁性及可修饰性等综合评价中最适合进一步的生物医学实验。②细胞摄取实验表明纳米粒主要分布于细胞质中。③通过纳米粒摄取效率实验及升温实验间接证明了纳米粒的细胞内热疗；④鼠尾静脉注射实验表明纳米粒具有EPR效应,且其主要分布在肿瘤组织中；⑤MTT毒性实验表明制备的Fe3O4@PAA纳米粒对大细胞肺癌细胞H460,鼻咽癌细胞CNE-2、HNE-1均无明显毒性。第二部分交变磁场下Fe3O4纳米粒细胞内热疗增加肿瘤放射敏感性目的：①Fe3O4@PAA纳米粒被肿瘤细胞吞噬,在交变磁场作用下对肿瘤细胞进行细胞内热疗,联合放射治疗,检测其对肿瘤细胞的杀伤作用,探讨其在肿瘤放射增敏中的应用及初步机制。②将Fe3O4@PAA纳米粒进行鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤瘤体内注射,在交变磁场下进行热疗,联合放疗作用,测量瘤体体积,探讨其对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的放射增敏作用。方法：①MTT法检测纳米粒在交变磁场下及联合放疗对H460、CNE-2及HNE-1三种肿瘤细胞增殖的抑制作用；②克隆形成实验检测纳米粒在交变磁场下细胞内热疗对三种肿瘤细胞的放射增敏作用；③Western-blot实验检测三种肿瘤细胞在经过处理后其HSP70及caspase-3蛋白的表达变化；④流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测纳米粒在交变磁场下细胞内热疗及联合放疗后三种肿瘤细胞的凋亡；⑤流式细胞术PI单染法检测纳米粒在交变磁场下肿瘤细胞的周期变化；⑥γH2AX焦点实验检测三种肿瘤细胞放疗联合纳米粒交变磁场下热疗与单独放疗相比,其焦点数目随时间的变化情况；⑦鼻咽癌低分化鳞状细胞系CNE-2的裸鼠移植瘤瘤体内注射纳米粒,置于交变磁场下热疗,联合放疗分组,检测瘤体增长,绘制瘤体生长曲线,检测其对瘤体组织的放射增敏作用。结果：①MTT结果显示：H460细胞：放射治疗组细胞存活率61.7±4%,联合纳米粒细胞内热疗后细胞存活率42±5%；CNE-2细胞：放射治疗组细胞存活率60.1±1.9%,联合纳米粒细胞内热疗后细胞存活率40.6±1.4%；HNE-1细胞：放射治疗组细胞存活率56.2±2.6%,联合纳米粒细胞内热疗后细胞存活率36.7±1.1%。②克隆形成实验结果：H460细胞的纳米粒细胞内热疗SER=1.3847; CNE-2细胞的纳米粒细胞内热疗SER=1.2755; HNE-1细胞的纳米粒细胞内热疗SER=1.4421。③Westerblot检测结果显示：三种肿瘤细胞的蛋白表达量趋势相同：对照组细胞HSP70表达较低,纳米粒组与对照组表达相当,纳米粒在交变磁场下作用后其表达量明显增高(P<0.01)；与放疗联合作用后其表达量与放疗组相比明显增高(P<0.01);caspase-3的表达具有同样的趋势。④流式细胞术凋亡检测结果：H460细胞：放射治疗组细胞凋亡率24.57±0.6545%,联合纳米粒细胞内热疗后细胞凋亡率34.92±0.6983%；CNE-2细胞：放射治疗组细胞凋亡率25.77±0.3332%,联合纳米粒细胞内热疗后细胞凋亡率60.53±0.8386%；HNE-1细胞：放射治疗组细胞凋亡率18.09±0.1170%,联合纳米粒细胞内热疗后细胞凋亡率48.35±0.3837%。⑤流式细胞仪周期检测结果：H460细胞对照组G2细胞=5.22±0.028%,纳米粒细胞内热疗G2期=30.82±3.32%；CNE-2细胞对照组G2细胞=6.72±2.16%,纳米粒细胞内热疗G2期=24.24±1.47%；HNE-1细胞对照组G2细胞=6.65±0.33%,纳米粒细胞内热疗G2期=37.19±1.25%。⑥y H2AX焦点检测结果：三种肿瘤细胞的焦点数随着时间延长均逐渐减少,在处理后2h内,处理组与对照组细胞的焦点数并无明显差异,而在处理4h后,细胞内热疗联合放疗组的焦点数量明显大于单独放疗组(P<0.01)。⑦成功建立了人鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠移植瘤模型,瘤体生长曲线可见纳米粒细胞内热疗组裸鼠的肿瘤体积随时间延长其增长明显减缓,对比对照组有明显差异(P<0.01)；细胞内热疗联合放疗组裸鼠的瘤体体积随时间延长瘤体体积明显减小,与放疗组相比差异有显著性(P<0.01)。结论：①通过MTT肿瘤抑制实验及克隆形成实验证明了纳米粒细胞内热疗的放射增敏作用；②初步探明了纳米粒细胞内热疗放射增敏的机制：通过增加HSP70蛋白及caspase-3蛋白的表达,增加了肿瘤细胞的凋亡；纳米粒细胞内热疗使肿瘤细胞阻滞在G2期,而G2期细胞对放射线敏感,且细胞内热疗能延缓了放射线致肿瘤细胞DNA双链断裂的修复,从而达到放射增敏的效果。③裸鼠移植瘤实验也证明了Fe3O4@PAA纳米粒细胞内热疗增加了肿瘤组织的放射敏感性。