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目的:1构建脂联素(adiponectin,ADPN)的重组抗原以制备脂联素单克隆抗体,并利用单克隆抗体研发脂联素的酶联免疫试剂。2研究N末端B型利钠肽前体(amino-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-pro BNP)和脂联素作为诊断急性心力衰竭指标的异同。方法:1利用PTO-T7载体构建脂联素的克隆,并在N端引入6个His标签,然后在大肠杆菌中获得表达,最后经过金属螯合层析柱获得纯化抗原。使用传统的单克隆抗体制备技术研制人脂联素相关抗体,再用酶联免疫的双抗体夹心法筛选出检测脂联素抗原的配对单克隆抗体,建立脂联素的定量ELISA试剂盒。2收集厦门市心脏中心于2015年4月至2015年6月间因胸痛胸闷、哮喘、胸部受压、呼吸困难等疑似合并心功能衰竭的患者407例,其中218例被确诊为急性心衰,所有患者均完成NT-pro BNP,ADPN等指标检测。(1)将确诊为心衰的患者按照美国纽约心脏病协会(NYHA)分级和病因学(非缺血性和缺血性)分析,比较ADPN和NT-pro BNP在各种分组中的水平差异。(2)分析ADPN、NT-pro BNP与肌酐和肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)二种肾功能指标的相关性。(3)将研究对象分成肾功能正常组(GFR≥60 ml/min/1.73m2)和肾功能异常组(GFR<60 ml/min/1.73m2),通过受试者工作特征曲线比较ADPN、NT-pro BNP以及二者联合应用在肾功能正常组和肾衰组的诊断价值。结果:1对人脂联素基因进行PCR扩增,扩增后的产物经行诱导表达、纯化、鉴定出具有活性ADPN抗原片段,使用该抗原片段免疫小鼠,成功筛选出31株可稳定表达脂联素抗体的杂交瘤细胞株。并利用其中的二株m Ab-7B5和1E2-1来配对研制定量的酶联免疫方法的试剂盒。2 ADPN和NT-pro BNP在血清中的水平,急性心衰组大于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。两种指标都与心衰的严重程度大致呈正相关,心衰组按照纽约心脏病学会分组(NYHA分级)分为I级、II级、III级和IV级。ADPN的血清水平随着分级升高大致升高,I级>对照组P=0.04、II级>I级P=0.116、III级>II级P=0.006、IV级>III级P=0.041。NT-pro BNP的血清水平在各组中,I级>对照组P=0.262,II级>I级P=0.019,III级>II级P=0.0542,IV级>III级P=0.024。缺血性心衰患者血清中ADPN水平低于非缺血性心衰患者(P=0.023),而NT-pro BNP水平在这两种心衰患者血清中表达水平无统计学差异(P=0.81)。3 ADPN与肾功能指标的相关性低于NT-pro BNP。对照组中,ADPN与GFR和肌酐无相关性,P值分别为0.213、0.121。而NT-pro BNP与二项指标均相关(P<0.05)。R值为-0.488和0.386。在急性心衰组中,ADPN和GFR、肌酐的无相关性,P值分别为0.164、0.288(P<0.05)。该组中NT-pro BNP与GFR和肌酐均相关,R值分别为-0.412和0.343(P<0.01)。4所有研究对象按GFR=60 ml/min/1.73m2分成肾功能正常组和肾功能异常组,肾功能正常组中,NT-pro BNP的诊断价值高于ADPN(AUC=0.91vs0.76灵敏性、特异性分别为93.1%vs43.9%和72.3%vs94.9%),差异具有统计学意义(P<0.05)。肾功能异常组中ADPN(AUC=0.87,灵敏性65.4%,特异性91.5%)的诊断价值等同NT-pro BNP(AUC=0.83、灵敏性90.4%、特异性67.8%),二者无统计学意义(P=0.34),但ADPN的特异性明显高于NT-pro BNP。5肾功能正常组按照年龄分为>75岁、50-75岁和<50岁,三组中ADPN的最佳cutoff值分别为9.76ug/ml、8.21ug/ml和8.76ug/ml。NT-pro BNP的最佳cutoff值分别为1497pg/ml、335pg/ml和221.5pg/ml。肾功能异常组同样按照上述方法分组,三组中ADPN的最佳cutoff值分别为>75岁组11.98ug/ml、50-75岁组9.57ug/ml和<50岁组7.89ug/ml。NT-pro BNP的最佳cutoff值分别为>75岁组1129.5pg/ml、50-75岁组1219pg/ml和50-75岁组972.35pg/ml。6联合诊断:采用logistic回归分析法将ADPN和NT-pro BNP做回归方程,检测结果进行回归分析,计算方程的预测因子。肾功能正常组中,联合诊断(AUC=0.92、灵敏性95%、特异性75.9%)与单用NT-Pro BNP的诊断价值之间的差异无统计学意义(P=0.12)。在肾功能异常组中,联合检测(灵敏性90.4%、特异性98.3%、AUC=0.90)高于单独使用NT-pro BNP(P=0.016)或ADPN(P=0.024)。结论:1研制出脂联素单抗并和定量的脂联素酶联免疫试剂盒,可应用于后续临床样本的评价。2 ADPN和NT-pro BNP在急性心衰血清中表达均升高,且与严重程度大致呈正相关。与肾功能(肌酐,GFR,胱抑素C)的相光性,ADPN低于NT-pro BNP。在诊断心衰时不受肾功能和年龄因素的影响;3在诊断肾衰合并心衰时,NT-pro BNP与ADPN二者联用的诊断价值明显高于任一单个指标。